今天这篇文章挺有意思的，讲的是线粒体代谢重编程以及类器官。这篇文章就是山东第一医科大学附属山东省立医院的刘毅团队的硕士生和副教授，共一发表在11.4分的 J Exp Clin Cancer Res.上的文章。我们就来看看，他们在这个课题中是具体怎么一步步推理的吧：
他们研究的是LUAD（肺腺癌），他们之前的研究发现线粒体核糖体蛋白MRPL12，是一种新的线粒体转录调节基因。这篇文章就围绕着MRPL12进行了研究。p53的缺失和K-Ras的突变（这俩一个是调控p53信号通路，一个涉及到了Ras信号通路，不熟悉这些信号通路的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列），通常会诱导肿瘤的发生。他们在p53-/-；KrasG12D杂合突变的小鼠中，进行了肺部特异性的MRPL12敲除，结果发现，肺特异性敲除MRPL12后，p53-/-；KrasG12D杂合突变的小鼠的肺部肿瘤，得到了明显的抑制：
于是他们对这个现象，提出了自己的假设，假设MRPL12的表达可能与肿瘤相关。为了证明这一点，他们分析了LUAD的PDO（类器官），以及LUAD的组织和细胞样本。通过对这些样本的分析，他们发现MRPL12在LUAD类器官、组织和细胞中都有着较高的表达，并且MRPL12的高表达与生存率差相关：
为了进一步验证MRPL12对于肿瘤的促进作用，他们又进行了体内外的实验，通过过表达或敲减MRPL12，来分析MRPL12对于肿瘤表型的贡献（这个其实就是柯霍氏法则的验证，通过MRPL12的表达和肿瘤的关系，假设两者相关，并通过反向遗传学的操作，确定MRPL12对于肿瘤的发生以及进展的功能，不清楚柯霍氏法则或者反向遗传学的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果发现MRPL12的确能促进LUAD肿瘤的发生以及穿越血管内皮细胞的运动型：
那么MRPL12促进肿瘤的机制又是什么呢？这就需要考虑MRPL12本身的功能了，由于MRPL12是一种线粒体核糖体蛋白，同时可以调控线粒体基因的转录。那就不由得把假设迭代到MRPL12可能是通过线粒体的功能，促进了肿瘤的进展。于是他们就分析了一下MRPL12对于线粒体功能的影响，通过SeaHorse实验（下图这种OCR耗氧率的曲线，这个在《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡那几章里，已经介绍过了，不清楚的话，可以回去看看）可以看到，MRPL12可以有效促进线粒体的OXPHOS（氧化磷酸化），而敲减MRPL12则能导致线粒体结构畸变：
通过上述实验，可以总结一下假设的验证，也就是MRPL12可能是通过促进线粒体的OXPHOS，促进了肿瘤细胞的线粒体功能，从而激活了肿瘤的进展。那么MRPL12又是通过什么来促进OXPHOS的呢？他们就使用MRPL12进行了免疫共沉淀，通过质谱验证发现MRPL12与UBASH3B之间存在相互作用。接着，他们进一步对UBASH3B进行缺失突变，结果发现缺乏SH3结构域的UBASH3B，不能与MRPL12相互作用，也就是说UBASH3B通过其SH3结构域，在特定相互作用中成为MRPL12的伴侣：
那么UBASH3B与MRPL12的结合，又是怎么影响线粒体功能的呢？首先他们敲减了UBASH3B，确定了UBASH3B本身也可以影响线粒体的功能。就UBASH3B本身而言，它具有酪氨酸蛋白磷酸酶活性（可以对磷酸化的氨基酸残基，去磷酸化）。根据这些信息，他们假设UBASH3B可能会影响MRPL12的磷酸化修饰水平。MRPL12有两个磷酸化位点Y60和Y152残基，而UBASH3B的H391残基则是其酪氨酸磷酸酶活性残基。他们并没有简单地仅凭直接敲减UBASH3B来确定其功能，而是通过分别进行了MRPL12的Y60A和Y152A突变，以及UBASH3B的H391A突变，通过分别将残基突变成丙氨酸，使其功能失活，以此来分析具体的功能与表型之间的联系（这就相当于他们将原有的UBASH3B与MRPL12的表达与线粒体功能的关系这样的命题，缩小了外延，变成了UBASH3B与MRPL12的互作功能，影响了MRPL12的磷酸化，导致了最终的线粒体表型，这样就避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题、外延和肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果显示UBASH3B通过其酪氨酸磷酸酶活性，调节MRPL12的Y60残基的磷酸化，通过线粒体激活，促进了LUAD的发展：
MRPL12的Y60残基磷酸化水平，与其功能作用之间存在直接关联，那么MRPL12的Y60残基磷酸化水平又是怎么样影响线粒体具体功能的呢？他们发现MRPL12的Y60残基磷酸化水平，可能与线粒体的发生及生物合成有密切关系。那线粒体生物合成的关键，就是mtDNA上转录增强，而文献显示MRPL12可以直接结合并激活POLRMT（线粒体 RNA 聚合酶），从而调节线粒体生物合成。而通过对MRPL12的Y60A突变，他们发现MRPL12的Y60A突变，减弱了内源性MRPL12和POLRMT之间的互作。而UBASH3B的表达增强，也能阻遏MRPL12和POLRMT之间的互作。也就是说，UBASH3B很可能是通过介导MRPL12的Y60残基去磷酸化，选择性抑制了MRPL12与POLMT的结合，从而导致线粒体功能障碍和LUAD恶性表型受到抑制：
最后他们进行了MRPL12的Y60A突变的体内验证，确定了MRPL12的Y60残基去磷酸化，可以抑制肿瘤形成、转移，以及类器官形成：
最后就形成了这样的示意图，UBASH3B可以通过SH3结构域，与MRPL12的特异性结合，使MRPL12中的Y60残基去磷酸化。MRPL12的Y60残基磷酸化水平的降低，阻碍了MRPL12与POLMT的结合，下调了LUAD细胞中的线粒体代谢，会抑制肿瘤的进展：
这篇文章推进的过程就非常有意思，从一个线粒体相关的基因，一步步推断出其功能，通过与其互作的蛋白，分析出造成功能的原因，这都是假设迭代的结果。同时他们并没有从表达的角度来分析MRPL12造成的影响，而是精准地找到了MRPL12的具体功能相关的氨基酸残基，并进行了突变（这就有效地避免了肯定后件的逻辑谬误，使得这个课题相对来说更为严谨，不清楚假设迭代以及肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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