作为体外诊断的一个分支，液体活检作为一种非侵入式的血液检测，能够监测肿瘤原发灶或转移灶所释放到血液中的循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA），已成为近年来用于癌症基因检测、辅助治疗的突破性技术，并正在逐步进入临床。
随着科学家对ctDNA的研究进一深入，ctDNA正在被开发用于肿瘤早筛、癌症用药监测等多个领域。但ctDNA的应用潜力还不止如此，目前研究人员正在探索利用微滴式数字PCR（ddPCR）技术来寻找并分析与免疫疗法反应相关的ctDNA，以及治疗后出现的肿瘤稳定或增长的疗效延迟现象，即假性进展。
目前，科学家已经发现了大量的与肿瘤和免疫细胞相关的特征分子，并作为潜在分子标志物，用于免疫检查点抑制剂的作用靶点。然而，临床医生在选择某种治疗策略后，往往还需要一些确认有效的分子标志物以评估治疗的效果，尤其是对那些在肿瘤常规检查和相关的“实体瘤的疗效评价标准”（RECIST）评分结果并不好的治疗措施，更需要依靠这些分子标志物判断是否要开展或放弃某个治疗方法。
近期大量研究表明，基于ctDNA的动力学变化可以用来追踪免疫疗法的效果并制定免疫疗法的相关方案。但是，该方法仍很依赖于ctDNA检测的准确性。
Bio-Rad公司科学事务主任George Karlin-Neumann表示，这种检测方法可以通过ddPCR试验来实现，即通过靶向检测相关的驱动突变，例如黑色素瘤中的BRAF V600E突变。但是对于某个特定患者的肿瘤而言，这种数字检测还可以更加个性化。
Karlin-Neumann谈道：“根据我们对肿瘤的了解情况，可以寻找一些患者特异性分子标志物，在测序数据分析过程中进行分析，这些标志物还可以转换成一种数字试验用于动态监控。”他还表示，当需要对一个患者的大量样本进行分析时，ddPCR试验的速度、成本和灵敏度都非常有优势。
案例一：ctDNA水平变化揭示免疫治疗反应
早在去年，在Clinical Cancer Research期刊发表的一项研究中，美国国家癌症研究所（NCI）的Mark Raffeld研究团队利用BRAF V600E突变作为分子标志物追踪ctDNA，同时还利用等位基因特异性TaqMan PCR对来自四十八名转移性黑素瘤患者的纵向血液样本进行检测，这些患者曾接受了过继性T细胞免疫治疗。
研究结果揭示了患者血液中ctDNA的早期跳跃，这些患者都对过继性和活性自体肿瘤浸润淋巴细胞治疗有明显反应：那些完全应答的患者在1年或2年后体内的ctDNA水平明显升高；随后，在V600E突变为阳性的转移性黑素瘤患者体内，ctDNA水平快速降低。
“患者在接受肿瘤浸润性淋巴细胞治疗后的30~60天内，非上皮性RECIST靶点不会出现明显的改变，而且在1~2年内通常都无法完全确认应答反应。”文章作者写道，他还表示，“我们非常需要分子标志物来提供与应答反应的可能性和持续时间相关的早期信息，这样可以帮助我们选择合适的治疗方法。”
Karlin-Neumann表示，分析结果还表明ctDNA动力学分析与其他应答类型相关，包括部分应答和无应答。这表明ctDNA动力学可能在早期提供扭转或调整治疗方案的机会。他称这项研究“如果可以重复的话，就太令人兴奋了。”
案例二：ctDNA水平揭示治疗进程及假性进展
上个月，在芝加哥举办的ASCO年会上，来自格罗宁根大学医学中心的研究人员发现，在晚期非小细胞肺癌患者体内存在一个类似的ctDNA水平的早期峰值，这些患者都对抗PD-1药物Opdivo有反应。
该研究小组将视线聚焦于一种特殊的KRAS突变，他们在6名肺癌患者原始肿瘤的前瞻性分析中鉴定出该突变，在治疗前、治疗开始后1周、2周、4周和6周分别收集血样，使用ddPCR分析血液样本中的ctDNA。并在接受治疗6周后，每三个月收集一次样本。4名出现应答反应的患者在接受治疗一周内体内ctDNA水平升高，随后利用关注KRAS突变的ddPCR检测到ctDNA水平逐渐降低。
如果这类研究成功的话，一些研究人员思考ctDNA动力学或许可以在某人免疫治疗步入正轨时帮助决策，即使肿瘤成像显示的可能是假性进展等情况。
案例三：精准鉴别仍待改进
一支来自澳大利亚的研究小组采取了一种略有不同的策略，他们同样在ASCO年会上展示了其研究结果。澳大利亚麦考瑞大学高级讲师Jenny Lee团队使用ddPCR梳理了转移性黑素瘤患者的ctDNA分析结果，这些患者在抗PD-1检查点阻断免疫治疗中存在假性进展并最终出现应答反应。
Lee谈道：“我们将放射性假性进展患者和真正进展的患者进行了对比。这些假性进展的患者在经过最初的肿瘤增长后出现缩小，而肿瘤真正发生进展的患者则是肿瘤病灶日益增长，而且在随后扫描检测中不断增长。”
在一组研究中，29名转移性黑色素瘤患者接受了PD-1抑制剂治疗，研究人员根据他们在治疗后的临床进展或RECIST分数以及治疗反应进行评估，鉴定出9人出现假性进展。
假性进展的患者中有7人在近2年的跟踪调查出现了持续性反应，其余2人在7或18个月后出现后续的疾病恶化。
通过利用ddPCR对患者肿瘤组织中鉴定出的特异性的BRAF或NRAS突变进行检测，研究人员追踪了接受治疗的前三个月内血液样本中的ctDNA含量（通常是治疗的第6~8周和第12周）。
从这些数据来看，研究人员发现假性进展患者通常会在治疗的前几个月中ctDNA水平较低或者出现骤降，而真正发生疾病进展的患者则在治疗3个月内ctDNA水平稳定或升高。
这些结果可能与其他研究小组报道的在免疫治疗应答者体内早期ctDNA升高现象不同。Lee解释道，分析所含的大部分血样都是在接受抗PD-1治疗的几周内采集的。但是两名假性进展患者在接受治疗1周后进行血液检测时，发现体内ctDNA水平明显上升。
“我想到我们实际上错过了很多患者的早期ctDNA峰值。”她解释道，“但不管怎样，我们认为一周抽血六次能够更加准确地预测患者的总体反应以及存活率。”
虽然这个现象总体来说相对较少见，但是假性进展的存在表明仅靠肿瘤成像技术是无法提供足够的信息来判断某个治疗策略是否合适的。因此，使用ctDNA作为患者预后的预测是非常有利的，尤其是对于假性进展更加常见的治疗类型，例如黑色素瘤的治疗。
Lee强调：“准确分辨假性进展和真正进展的患者非常重要。这不仅为我们提供了预后信息，还改变了患者的管理方式”
这项在ASCO会议上展示的假性进展分析来源于一项包含100多人的大型ctDNA研究，这些人在基线和抗PD-1药物治疗期间，或二者相结合的情况下进行了检测。
此外，其团队还使用ddPCR追踪了脑转移瘤患者、其他早期癌症患者和接受不同类型治疗方法患者的ctDNA模式。
通过在不同应用领域中使用ctDNA，科研人员或许可以尝试去理解这个分子标志物的更多生物学功能，同时还可以试图将这项技术作应用于临床中，而不仅仅作为一个研究工具。
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