基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
即将过去的6月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？我们梳理了一下这个月报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.JCI：CRISPR/Cas9基因编辑技术有望治疗亨廷顿舞蹈症
doi:10.1172/JCI92087
图片来自Journal of Clinical Investigation,
doi:10.1172/JCI92087
亨丁顿舞蹈症（Huntington's disease,
HD）是一种遗传性神经退行性疾病。破坏脑细胞中的一种有问题的基因能够逆转亨丁顿舞蹈症病理和运动症状。
亨丁顿舞蹈症是由编码一种被称作突变的亨廷顿蛋白（mutant huntingtin,
mHTT）的毒性蛋白的基因导致的。mHTT蛋白在脑细胞中形成聚集物，从而导致脑细胞死亡。它的症状通常在中年时出现，包括不受控制的运动、平衡问题、情绪波动和认知下降。
在一项新的研究中，来自美国埃默里大学医学院、中国科学院和暨南大学的研究人员在在9个月大的亨丁顿舞蹈症模式小鼠中利用通过一种病毒载体运送的CRISPR/Cas9切除它们的脑细胞中的mHTT基因的一部分。几周后，在大脑中接受这种病毒载体注射的地方，这些蛋白聚集物几乎消失了。此外，这些小鼠的运动能力得到改善，不过没有恢复到健康小鼠的水平。相关研究结果于2017年6月19日首次发表在Journal
of Clinical Investigation期刊上，论文标题为“CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates
neurotoxicity in mouse model of Huntington’s
disease”。
论文通信作者、埃默里大学医学院人类遗传学知名教授Xiao-Jiang
Li博士说，尽管还需开展安全性和长期效果测试，但是这些发现为治疗亨丁顿舞蹈症和其他的遗传性神经退行性疾病打开新的途径。
2.CRISPR-Cas9更容易发生脱靶突变吸人眼球，已导致一些CRISPR公司股票下降
doi:10.1038/nmeth.4293
上周，一项研究声称CRISPR-Cas9基因组编辑技术比预期中的更容易发生错误，这让它成为了全世界的头条新闻。也因此，一些投资者出售他们持有的基于CRISPR的生物技术公司的股票，这导致一些公司的股票价格下降高达15%。
在这项于2017年5月30日在线发表在Nature
Methods期刊上的研究中，对脱靶效应的分析源自美国哥伦比亚大学的Stephen
Tsang及其同事们在2016年开展的一项研究：他们利用CRISPR-Cas9技术成功地修复小鼠胚胎中一种导致失明的基因突变。在该项研究完成后，论文共同作者、美国斯坦福大学眼科医师VinitMahajan发现有机会研究酶Cas9如何容易发生错误。
Mahajan和他的同事们对来自他们的2016年那项研究中储存的组织样品的基因组进行测序，并且将它们与已发表的小鼠序列数据进行比较。在这些组织样品序列中存在的但在公共序列数据库中不存在的突变被鉴定为CRISPR介入导致的脱靶突变。
Mahajan团队对这些结果感到吃惊：两只接受CRISPR处理的小鼠发生的突变比预期中的多10倍。更令人担忧的是，在这些突变中，没有一种突变存在于利用计算机算法预测到的Cas9脱靶位点之内。
Mahajan告诉《科学家》杂志，“这些全基因组序列似乎在未被预测的区域中发生突变。这提示着利用体外培养的细胞开展的实验可能并不能较好地预测当被注射到整个有机体内时，CRISPR蛋白是如何作出表现的。”
Mahajan提醒道，“这是一项非常小型的针对性研究：探究了小鼠中的单个基因。我们需要开展更多的研究来理解脱靶效应如何发挥作用，以及它如何在不同的情形下出现。”
澳大利亚国立大学遗传学家GaétanBurgio说，他对这一发现并不感到吃惊。他说，“不同寻常之处在于这种脱靶效应的幅度”，不过他指出这种结果存在其他的解释。Burgio告诉《科学家》杂志，“很多脱靶突变不可能是由CRISPR导致的。”
Burgio继续说道，这项研究存在的一个重大的缺陷是采用已发表的序列数据，而没有设置对照小鼠，即放置在相同的实验室条件下但未接受Cas9蛋白注射的动物。“在你的研究机构中使用的小鼠与那些已被测序过的小鼠存在基因漂移。”Burgio说，由于这一点，这项研究不能够“梳理出哪些变异体是由于自然的基因变异导致的，哪些变异体是与CRISPR相关的。”
为了支持这种看法，批评者注意到这两只小鼠都具有很多相同的纯合突变，这意味着相同的变异体存在于染色体的两个拷贝上。这提示着它们可能是从一个相同的祖先遗传下来的，而且在进行CRISPR处理之前就已存在于这些小鼠体内。Burgio说，“就我的个人经验而言”，利用CRISPR-Cas9在两只不同的小鼠中“产生两种完全一样的点突变是非常罕见的”。
批评者也声称这篇论文存在着明显的错误，比如不正确地鉴定脱靶位点，这可能影响着这些结果的可靠性。Mahajan并没有提供详细的反驳意见，但是将这些批评意见描述为是“非常错误的”。
不过，这项小型的初步研究足以吸人眼球，吓坏投资者，比如几家使用CRISPR基因编辑系统的生物技术公司看到它们的股票价格下降高达15%。Baral说，这种反应是较为罕见的，“但是当你的研究领域非常引人关注时，发生这种情形绝对不是没有听说过的。”
3.CRISPR装备噬菌体让“超级细菌”自杀！
图片摘自www.pixabay.com
众所周知，CRISPR系统本来是细菌抵抗外界病毒侵染的免疫手段，但也许未来的某一天，CRISPR技术能够帮助人们杀伤细菌本身。通过改造噬菌体使其携带CRISPR操作元件，科学家们希望这一工具能够对耐药性细菌进行有效杀伤，并且能够用于改造机体的微生物组。
利用噬菌体杀伤细菌已经不是新鲜的概念了，相关的临床治疗最早可追溯至1920年。这一方法之所以十分令人感兴趣，原因在于其特异性远高于抗生素：仅仅对特异性的靶标细菌进行杀伤。此外，病毒还能够刺透黏状的细菌外膜，从而提高其杀伤水平。
目前，许多研究机构以及生物公司都在不断挑战CRISPR技术的界限，包括设计特异性识别抗生素耐药性基因的CRISPR序列，
从而对耐药性细菌进行有效杀伤。
4.“基因魔剪”专利之争：中国专利没授予张锋，给了他的对手
“基因魔剪”CRISPR/Cas9
技术的专利之争又有了新进展。尽管今年年初在美国本土失利，但后续，欧洲专利局和英国专利局称，美国加州大学伯克利分校将获得有广泛使用范畴的 CRISPR/Cas9
技术专利。如今，加州大学伯克利分校又将赢得来自中国的一分。
美国时间和瑞士时间当地 6 月 19 日，Intellia Therapeutics
和 CRISPR Therapeutics 两家公司相继发布消息称，其已经获得中国国家知识产权局授予的在 CRISPR
基因编辑技术上的专利。
5.Nat Chem
Biol：突破！科学家成功优化CRISPR-Cpf1技术使其更加高效地编辑人类基因组
doi:10.1038/nchembio.2410
图片来自iStock/Vchal。
近日，一项刊登在国际杂志Nature Chemical
Biology上的研究报告中，来自斯克里普斯研究所的研究人员通过研究改善了当前最先进的基因编辑技术，使其能够更加精准地靶向切割并且粘贴人类和动物细胞中的基因，同时研究者还扩展了CRISPR-Cpf1基因编辑系统使其能够用来研究以及帮助抵御人类疾病。
文章中，研究人员通过将导向RNAs和“复用”能力合并，改善了CRISPR-Cpf1基因编辑系统的作用效率；研究者Guocai
Zhong说道，这种系统能够简单、明显改善同时对多个基因或单个基因多个位点的编辑能力，这或许对于靶向作用多个疾病相关的基因或疾病相关基因的多个位点非常有帮助。
研究者Farzan指出，效率是非常重要的，如果你能够修饰肝脏中的25个细胞，似乎是无意义的，但如果能够对肝脏中一半的细胞进行修饰，那么这或许具有重大意义。当然如果该系统还能够帮助修复肌肉细胞中基因的话，或许就能够帮助恢复患者的肌肉功能。目前Cas9和Cpf1是最常用的两种分子剪刀，研究者Farzan重点对Cpf1进行关注，因为其能够更加精确地对哺乳动物细胞进行作用，Cpf1分子来自两种类型的细菌：拉克诺螺旋菌科细菌和嗜酸菌属细菌，这些分子的关键特性就是能够对RNAs进行引导，但目前研究人员并不清楚这些分子如何同哺乳动物细胞所产生的RNA发生作用，文章中，研究者通过将萤火虫发光基因编辑到细胞的染色体中进行深入研究，随后他们发现，这种修饰后的CRISPR-Cpf1系统能够像预期一样发挥作用。
6.Sci
Rep：高胰岛素血症细胞模型和雄激素促进胰腺β细胞分化研究获进展
doi:10.1038/s41598-017-03349-w
6月9日，NPG系列期刊《科学报告》（Scientific
Reports）在线发表了中国科学院广州生物医药与健康研究院李尹雄课题组郭东升等的最新研究成果Modeling Congenital
Hyperinsulinism with ABCC8-Deficient Human Embryonic Stem Cells Generated by
CRISPR/Cas9，该研究建立了KATP通道失活型先天性高胰岛素血症干细胞模型并通过胰岛β细胞分化在体外模拟了先天性高胰岛素血症的相关临床症状。
该研究利用CRISPR/Cas9技术，在胚胎干细胞株H1的基础上，建立ABCC8基因失活突变细胞株。与野生型细胞株相比，ABCC8突变细胞株定向诱导分化的胰岛β样细胞具有更高的胰岛素和C-肽分泌效率，较好地在体外复制出先天性高胰岛素症的临床表现，文章进一步分析ABCC8突变胰岛β样细胞对各种不同促进或移植胰岛素分泌药物的反应，为体外高通量药物筛选模型提供了基础。
7.Cell
Res：一步到位 CRISPR彻底敲除动物体内特定基因
doi:10.1038/cr.2017.81
图片来自Bryan Satalino。
近期，自然出版集团旗下的《Cell
Research》期刊上在线刊登了一篇来自中国科学院神经科学研究所杨辉博士团队的最新论文。利用CRISPR基因编辑技术，研究人员能够通过简单的“一步反应”，彻底敲除小鼠或是猴子体内的特定基因。这一工具对于基础科研中动物模型的建立能起到提速的作用，意义重大。
在本项研究中，来自中国的科学家们做了一个新的设想——如果在受精卵内注射多条sgRNA，是否会提高基因敲除的效率呢？为了检验这个想法，他们让野生型的母鼠与带有纯合Actin-EGFP的公鼠进行交配，并在受精卵中注射入了Cas9
mRNA以及多条靶向GFP的sgRNA。这些sgRNA在GFP基因的外显子中相隔10-200个碱基对，研究人员们相信这样的设计能以更高的频率敲除特定基因。通过一系列实验，他们证实通过引入多条sgRNA，就可以极大提高在动物体内的CRISPR基因编辑效率，做到对特定基因的完全敲除。
接下来，研究人员又测试了这套系统在猴子里的效率。在猴子实验中，他们在29个胚胎中各自注射了3条靶向Prrt2基因的sgRNA，这个基因的突变会导致阵发性运动诱发的运动障碍（paroxysmal
kinesigenic dyskinesia，
PKD）。这些胚胎被移植入了9只代孕的母猴，并成功让其中一只母猴生下了两只小猴。其中一只小猴的组织样本表明，Prrt2基因得到了完全的敲除。这个结果也表明了这套系统在猴子体内的可行性。
接下来，研究人员分析了这套系统的脱靶效应。这篇论文提到，利用全基因组测序的手段，他们对活体动物进行了CRISPR潜在脱靶效应的评估。在小鼠的10201个潜在脱靶位点，以及猴子的19447个潜在脱靶位点中，他们发现的插入/删除突变（indels）并不多见。其中有6只小鼠和1只猴子的体内未检测出插入/删除突变。这也在一定程度上，支持了CRISPR技术的安全性。
8.Cell
Res：上海生科院等设计出高效精确基因靶向整合的新策略
doi:10.1038/cr.2017.76
5 月 19
日，《细胞研究》期刊在线发表了题为《运用 CRISPR/Cas9
技术实现以同源臂介导的末端接合为基础的靶向整合》的研究论文，该研究由中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组、基因编辑平台施霖宇团队与苏州非人灵长类研究平台孙强团队合作完成。该研究设计了一种以同源臂介导的末端接合（Homology-Mediated
End Joining，
HMEJ）为基础的基因敲入策略，它在很多种系统（体外培养的细胞、动物胚胎和体内组织）中比现有的基因敲入策略的效率都要高。基于更高效的编辑效率和更好的精确度，HMEJ
介导的基因敲入方法为一系列应用，包括基因编辑动物模型的建立、疾病的靶向基因治疗等提供了非常大的应用前景。
在临床治疗应用方面，精确的靶向基因组编辑是非常重要的。规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR
相关蛋白 - 9 核酸酶（Cas9）系统通过在基因组上靶向形成 DNA 双链断裂（DSB）的方式极大地促进了转基因的靶向整合。一旦产生一个
DSB，靶向整合可以通过多种策略来实现，包括同源重组（HR）、微同源臂介导的末端接合（MMEJ）或者非同源末端接合（NHEJ）。在本工作中，研究团队基于
CRISPR/Cas9 系统，设计了一种新的以 HMEJ 为基础的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导 RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约
800bp）的供体载体来实现高效的精确整合。
为了验证这一想法，研究团队构建了四种类型的供体载体来比较敲入效率：HMEJ 供体（sgRNA
靶向位置序列加在 800bp 长度的同源臂两端）、HR 供体（只有 800bp 长度的同源臂）、NHEJ 供体（只有 sgRNA 靶向位置序列）以及 MMEJ
供体（sgRNA 靶向位置序列加在 20bp
的微同源臂两端）。然后将这四种系统分别在体外培养的细胞系、小鼠和猴胚胎以及成体组织上进行效率比较。
研究者发现在体外培养的小鼠 ES 细胞和
N2a 细胞中，HMEJ 为基础的定向整合效率与 HR 方法相比较并无显着提高。然而，在原代星形胶质细胞和神经元细胞中，HMEJ 方法具有很高的 DNA
敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展现了非常强大的基因敲入能力。此外，通过尾静脉水动力注射法感染成体小鼠的肝细胞，发现 HMEJ
介导的基因敲入效率远高于以 HR、NHEJ 和 MMEJ 为基础的策略。采用 AAV 定点注射感染小鼠的视皮层区（V1），结果显示 HMEJ
介导的在成体非分裂的成熟神经元中靶向整合效率可以达到 50% 左右。最后，研究者对 HMEJ 介导的基因靶向整合的机制进行了探讨。
9.Sci
Rep：突破！利用CRISPR-Cas9技术开发出帕金森疾病新型筛选工具
doi:10.1038/srep45883
近日，一项发表在国际杂志Scientific
Reports上的研究报告中，来自中佛罗里达大学（University of Central
Florida）的研究人员通过研究利用突破性的基因编辑技术开发出了一种帕金森疾病的新型筛查工具，帕金森疾病是一种严重的神经系统疾病，这种技术能够帮助科学家们在实验室中对名为α-突触核蛋白的大脑蛋白进行实时监测，这种蛋白和帕金森疾病发病直接相关。
文章中，研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行研究，这种系统是科学家们近年来使用最为广泛的生物医学工具，其能够帮助科学家对植物和动物机体中的DNA进行精准化修饰，同时还不会杀灭正常细胞，如今这种新型的基因编辑系统慢慢地开始被研究人员用来开发治疗癌症和帕金森等疾病的新型疗法了。
CRISPR-Cas9基因编辑技术能够对活体细胞中的DNA进行改变，同时其在不杀灭细胞的情况下还能够实时对基因表达进行监测，如果没有这种新型基因编辑技术，我们可能会从细胞中提取出所有的蛋白质来对其测定，这无疑会对细胞产生杀灭作用。这项研究中，研究者Burnett及其同事利用CRISPR技术对α-突触核蛋白基因进行了编辑，并且在该基因中插入了一种荧光标记，每当细胞开始产生α-突触核蛋白时，荧光标记就会发光；而这种反应就能够被研究者们轻松观察到，研究者Adams说道，发光越多就意味着α-突触核蛋白的水平增加越明显，这时候我们就要考虑是否个体已经处于疾病状态了。他们发现，对光进行测定时一种测定α-突触核蛋白产量的可靠方法；如果利用特殊药物来处理任何一个被修饰的细胞，如果细胞不再产生荧光，那就意味着这种药物或许能够用来治疗疾病。对细胞进行工程化修饰后，研究者就能够对新型和当前已经存在的药物进行筛选来观察期如何调节患者机体中α-突触核蛋白的水平。
10.Sci
Rep：科学家有望利用CRISPR-Cas9成功治疗多种遗传性疾病
doi:10.1038/s41598-017-02927-2
日
前，一项发表在国际杂志Scientific
Reports上的研究报告中，来自皇后大学的研究人员通过研究利用基因编辑工具成功治疗了遗传性疾病，相关研究或为后期研究人员开发新型疗法治疗罕见肝脏疾病及由遗传突变诱发的其它疾病提供思路和希望。
文章中，研究者利用携带诱导基因缺失的细胞模型进行研究，最后开发出了能够模拟人类疾病的缺陷性精氨酸酶-1，利用CRISPR基因编辑系统，研究人员就能够将修复性的外显子重新插入到细胞的遗传结构中并且恢复酶类的功能。当然目前在细胞模型研究和全面的患者治疗之间还存在着许多障碍，研究者Sin解释道，一种新型的疗法或许明显优于当前方法给研究者带来很多帮助，当前治疗疾病的疗法受限于药理学制剂，比如氮清除药物以及限制蛋白质的饮食等，利用CRISPR基因编辑技术治疗精氨酸酶-1缺陷症或许就能够为研究者提供治疗其它相似遗传性疾病的新型疗法。
11.PNAS：上海生科院揭示DNA甲基化对番茄果实成熟的重要作用
doi:10.1073/pnas.1705233114
5 月 15
日，《美国科学院院刊》（PNAS）在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物逆境生物学研究中心朱健康研究组和郎曌博研究组题为 Critical roles of
DNA demethylation in the activation of ripening-induced genes and inhibition of
ripening-repressed genes in tomato fruit 的研究论文。该研究利用 CRISPR/Cas 9 技术获得了番茄 sldml2
的突变体植株，发现了番茄 SlDML2 调节的 DNA
去甲基化不仅可以激活成熟需要的基因，同时还可以抑制成熟不需要的基因，在调节番茄果实成熟的过程中发挥了重要作用。
在这项研究中，研究人员利用
CRISPR/Cas 9 技术获得了番茄 sldml2 的突变体，SLDML2 基因与拟南芥中的 DNA 去甲基化酶基因 ROS1
具有很高的同源性。由于该基因的失活，使得全基因组范围内的甲基化水平升高，诱导果实成熟的基因表达受到抑制，导致番茄果实不能正常成熟。进一步研究表明，SlDML2
参与了成熟相关基因的激活表达，主要参与了色素合成和口味形成、乙烯生物合成及信号传导途径、细胞壁水解等途径中。另外，令研究者意外的是，SlDML2 介导的 DNA
去甲基化也抑制了果实成熟中并不需要的基因的表达，这些基因大多是参与光合作用及细胞壁合成的基因。这项研究不仅发现了 SIDML2 基因的 DNA
去甲基化功能，而且揭示了 DNA 去甲基化在果实成熟发育过程中的重要作用，极有可能调控着果实成熟发育的精确度。该发现揭示 DNA
甲基化可能是转录因子和植物激素之外的第三个最重要的调节果实成熟因子，具有重要的理论和应用价值。
（本文转自生物谷）
面对生命，惟有责任
