摘
要：
目的
基于药性理论，通过对临床医保目录中抗白癜风中成药方药活性成分的筛选，对其有效成分进行初步药效学评价及机制探讨。
方法
收集抗白癜风中成药组方、药性和物质基础以筛选主药。通过
TCMSP
和
TCMIP
数据库得到主要化合物类型。使用
admetSAR
分析成药性得出关键化合物。通过成年斑马鱼和斑马鱼幼鱼的形态学、黑色素含量测定观察体内药效学。通过斑马鱼幼鱼存活率进行安全性评价。通过
RT-PCR
显示化合物在转录水平中的作用机制。使用分子对接预测化合物与蛋白晶体结构的结合能力。
结果
使用频次最高的主药为红花、紫草、蒺藜、龙胆、补骨脂和驱虫斑鸠菊。通过
TCMSP
和
TCMIP
数据库得到主要化合物类型为黄酮类，共有
81
个。根据成药性和稳定性筛选出甲氧基黄酮类化合物山柰素和异鼠李素。
32μmol/L
山柰素、
32 μmol/L
异鼠李素和
25 μmol/L
甲氧沙林均能促进斑马鱼黑色素再生。基于斑马鱼胚胎模型，
3
个化合物均能加速胚胎黑色素生成，且其有效浓度下斑马鱼幼鱼的存活率在
90%
以上。
RT-PCR
结果显示山柰素与异鼠李素上调黑色素生成关键基因黑素皮质素
1
受体（
MCIR
）和小眼畸形相关转录因子（
MITF
）
mRNA
水平。分子对接结果显示山柰素、异鼠李素与底物酶结合分数高于甲氧沙林。
结论
临床抗白癜风中成药组方中活性成分山柰素与异鼠李素促进斑马鱼模型黑色素生成且通过上调
MC1R/MITF
信号通路作用。
白癜风是一种慢性色素脱失性疾病，直接病因是黑色素细胞酪氨酸酶活性的降低或消失
[1]
。中医治疗白癜风有着悠久的历史，中医理论中白癜风是由于肝气郁结，气机不畅，复受风湿相搏于皮肤，致气血阴阳不和，日久而伤脾。肝亏肾虚，加之肝脾不和，致皮毛腠理失养
[2-3]
。维吾尔医学认为白癜风是由于黏液质的异常所致，其在性质上含有过度湿和过度寒，损害胃肠等脏器的正常生理功能，导致异常体液生成，由此形成恶性循环
[4]
。中医治疗白癜风多采用扶正祛邪的治疗原则，多用性温平，味甘、苦、辛的药材
[5]
；而维医治疗白癜风主张清除异常的黏液质，多用性温热，味辛、苦的药材
[6]
，临床抗
白癜风医保目录方药信息见表
1
。本文基于临床一线抗白癜风中成药的指导，从药性阴阳理论出发，寻找方
药中促进黑色素生成的活性成分并探讨其机制。
1
材料
1.1
实验动物
TU
系斑马鱼（成年斑马鱼及斑马鱼幼鱼各
200
条）购自南京尧顺禹生物科技有限公司。饲养条件为
光照
14 h
黑暗
10 h
，水温（
28.5
±
0.1
）℃
[7]
。
1.2
试剂
山柰素（质量分数≥
98%
，批号
R23N8F49014
）、异鼠李素（质量分数≥
98%
，批号
P09O8F45142
）、甲氧沙林（质量分数≥
98%
，批号
P30J7M16998
）均购自上海源叶生物科技有限公司；西班牙琼脂糖
Agarose G-10
（批号
111860
）购自天津沃德生物科技有限公司；
DMSO
（质量分数≥
99.9%
，批号
520C036
）购自北京索莱宝科技有限公司；新铜试剂（质量分数≥
98%
，批号
BCBT4986
）购买自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；甲苯胺蓝（批号
DB22BA0027
）、
UNlQ-10
柱式
Trizol
总
RNA
抽提试剂盒（批号
EA16KA9830
）均购自上海生工生物工程股份有限公司；
2
×
Taq PCR Mix
（批号
R7018
）购自北京天根生化科技有限公司；
Thermo ScientificRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
（批号
00738278
）购自
Thermo Fisher Scientific
。引物购自上海生工生物工程股份有限公司，引物序列见表
2
。
2
方法
2.1
临床医保目录中抗白癜风中成药的收集
通过登录药智数据库（
https://db.yaozh.com/
）得到目前医保目录中抗白癜风的中成药共计
11
个，其中维药
3
个。分别是外搽白灵酊
[
当归尾、红花、红花夹竹桃（叶）、苏木、没药、白芷、白矾、马齿苋）
]
、桃红清血丸
[
（蒺藜（炒）、紫草、降香、拳参、白薇、桃仁（炒）、红花、制何首乌、甘草、苍术（炒）、龙胆、白药子、海螵蛸
]
、润肌皮肤膏（大枫子仁、红粉、核桃仁、蓖麻子、樟脑、松香、蜂蜡）、白灵片（当归、三七、红花、牡丹皮、桃仁、防风、苍术、白芷、马齿苋、赤芍、黄芪）、白癜风丸（补骨脂、黄芪、红花、川芎、当归、香附、桃仁、丹参、乌梢蛇、紫草、白鲜皮、山药、干姜、龙胆、蒺藜）、白癜风胶囊（补骨脂、黄芪、红花、川芎、当归、香附、桃仁、丹参、乌梢蛇、紫草、白鲜皮、山药、干姜、龙胆、蒺藜）、白蚀丸
[
紫草、灵芝、降香、盐补骨脂、丹参、红花、制何首乌、海螵蛸、牡丹皮、黄药子、苍术（泡）、甘草、蒺藜、龙胆
]
、补骨脂注射液（补骨脂）、驱白巴布期片（补骨脂、驱虫斑鸠菊、高良姜、盒果藤、白花丹）、复方驱虫斑鸠菊丸（驱虫斑鸠菊、荜茇、王姜、阿纳其根、盒果藤根）、消白软膏（蛋黄、丁香、黑芝麻、黑种草子、芥子、阿育魏实、羊脂、硬脂酸、三乙醇胺、甘油、对羟基苯甲酸乙酯）。
2.2
成药性化合物分析及结构聚类
依托
TCMIP
数据库（
http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php
）和
TCMSP
数据库（
http://tcmspw. com
），对出现频次最高的红花、龙胆、紫草、蒺藜、补骨脂和驱虫斑鸠菊中的黄酮类化合物进行挖掘。整合去重后，通过
PubChem
数据库将化合物转化为
Canonical SMILES
格式，利用
admetSAR
方法（
http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/
）对化合物进行成药性分析。公式
1
定义如下。
其中
k
代表
CYP450 1A2
、
CYP450 2C9
、
CYP450 2D6
、
CYP450 2C19
、
CYP450 3A4
抑制剂。
Q
代表肝药酶总体预测精度。肝药酶抑制剂的总体预测精
度为
CYP450 1A2
抑制剂（
Q
＝
0.8147
），
CYP450 2C9
抑制剂（
Q
＝
0.801 8
），
CYP450 2D6
抑制剂（
Q
＝
0.855 1
），
CYP450 2C19
抑制剂（
Q
＝
0.805 4
），
CYP450 3A4
抑制剂（
Q
＝
0.645 0
）
[8]
。通过
OMIM
数据库（
https://omim.org/
）收集到
21
个临床抗白癜风药物，运用
PubChem
数据库将化合物转化为
Canonical SMILES
格式，并进行结构聚类分析
[9]
。
2.3
网络构建及其分析
通过
Cytoscape
软件中
Network Analyzer
插件分析抗白癜风组方的接近向量中心度，该值整体考量了每个结点到其他结点的最短路的平均长度，反映了网络中某一结点与其他结点之间的接近程度。
通过
Cytoscape 3.4.0
软件建立临床医保目录中成药
-
药材
-
药性
-
物质基础网络模型，分析化合物药性
[10
]
。
2.4
建立成年斑马鱼脱色素模型
根据白癜风的直接病因，使用铜离子螯合剂新
铜试剂（
550 nmol
/
L
）作用于成年斑马鱼
20 d
，使其尾部黑色素脱失，模拟临床白癜风色素脱失表征
[11]
。
2.5
成年斑马鱼黑色素生成定性实验
取
4
～
12
月龄成年斑马鱼
100
条，随机分为
4
组，每组
25
条。分别为对照组：
550 nmol
/
L
新铜试剂处理
20 d
，自然恢复黑色素再生
3 d
；阳性对照组：
550 nmol
/
L
新铜试剂处理
20 d
，
25 nmol
/
L
甲氧沙林处理
3 d
；异鼠李素组：
550 nmol
/
L
新铜试剂处理
20 d
，
32 μmol
/
L
异鼠李素处理
3 d
；山柰素组：
550 nmol
/
L
新铜试剂处理
20 d
，
32 μmol
/
L
山柰素处理
3 d
。使用体式解剖镜（
8
×
）进行皮肤黑色素再生观察
[12]
。取斑马鱼尾部组织进行冰冻组织切片，采用甲苯胺蓝染液染色，光学显微镜（
200
×
）观察
斑马鱼尾部皮肤横截面成熟黑素体及黑色素带的变化
[13]
。
2.6
成年斑马鱼黑色素生成定量实验
取每组
6
条斑马鱼皮肤，组织匀浆后使用含
10% DMSO
的
NaOH
（
2 mol
/
L
）溶液于
80
℃水浴
2 h
。离心吸取上清，于
350 nm
处获取吸光度（
A
）值
[14]
。与对照组相比，计算每
25 mg
皮肤中的
A
值。
A
＝
(
A
治疗
－
A
对照
)/(
A
对照
×
25 mg)
（
2
）
2.7
成年斑马鱼尾鳍再生实验
取
4
～
12
月龄斑马鱼，将其尾鳍截断
2/3
，治疗
1
～
2 d
。再生第
1
阶段（断鳍后
24 h
）与第
2
阶段（断鳍后
36
～
48 h
）新生基质中黑色素细胞分化量分别代表黑色素细胞分化早期分化标志物小眼相关转录因子（
MITF
）和晚期分化标志物受体酪氨酸激酶（
Kita
）和多巴色素异构酶（
DCT
）的表达
[15]
。对照组：断鳍后于纯水中自然生长尾鳍；阳性对照组：断鳍后于
25 μmol
/
L
甲氧沙林中生长尾鳍；治疗组：断鳍后分别于
32 μmol
/
L
异鼠李素与
32 μmol
/
L
山柰素中生长尾鳍。
2.8
成年斑马鱼尾鳍再生实验中新生原基的冰冻组织切片
取
4
～
12
个月龄斑马鱼，将其尾鳍斜切截断，使用
32 μmol
/
L
山柰素、
32μmol
/
L
异鼠李素和
25 μmol
/
L
甲
氧沙林处理
10 d
，取斑马鱼尾部新生原基进行横向冰冻组织切片，使用苏木素染液进行染色
[15]
。其中甲氧沙林处理组为阳性对照组，山柰素与异鼠李素处理组为治疗组。
2.9
斑马鱼幼鱼黑色素新生及胚胎存活率
斑马鱼胚胎每组
25
～
30
个，于受精后
6 h
给予
25
μmol
/
L
甲氧沙林，
32
μmol
/
L
异鼠李素和
32
μmol
/
L
山柰素，处理
72 h
后使用光学显微镜记录黑色素生成过程，并统计胚胎存活率
[16]
。其中甲氧沙林处理组为阳性对照组，山柰素与异鼠李素处理组为治疗组。
胚胎存活率
＝活胚胎数/总胚胎数
（
3
）
2.10
RT-PCR
凝胶电泳
提取斑马鱼幼鱼
RNA
，使用
Q5000
检测纯度与浓度；使用
cDNA
逆转试剂盒逆转成
cDNA
；使用
2
×
Taq PCR Mix
扩增，扩增条件为
38
个循环，
95
℃、
5 min
；
95
℃、
30 s
；
60
℃、
30 s
；
72
℃、
40 s
；
72
℃、
5 min
。通过
RT-PCR
凝胶电泳，检测产物并进行灰度值分析
[17]
。
2.11
分子对接
山柰素、异鼠李素与黑色素合成下游蛋白
MITF
、酪氨酸酶（
TYR
）、酪氨酸相关蛋白酶
1
（
TYRP1
），一起进行虚拟分子对接，使用甲氧沙林作为阳性对照。在
SYBYL-X 2.0
中使用
Surflex-Dock
对山柰素、异鼠李素和甲氧沙林进行对接和评分。将化合物模型通过
Surflex-Dock
（默认设置采样了统治弹性）对接到晶体结构蛋白质模型中，然后通过
Surflex-Dock
评分功能评分
[18]
。
2.12
统计学方法
采用
SPSS 20.0
进行统计学分析，结果以
表示，两组间比较采用
t
检验。
3
结果
3.1
基于临床医保目录抗白癜风中成药的网络整合
基于临床医保目录抗白癜风中成药的指导，将
11
个中成药组方收集，见表
3
。通过对使用频次位于前
20
的药材进行药性和物质基础的分析，建立中成药
-
药材
-
药性
-
物质基础的网络拓扑图，见图
1
。其中中药材出现频次最高的为红花（
6
次）。本文发现药性温热，味辛、苦、甘药材居多，且这些药材的物质基础中，黄酮类化合物占比最大。
3.2
黄酮类活性化合物中药动学预测参数
通过数据库与文献的挖掘，收集到龙胆中黄酮类化合物
10
个，蒺藜中黄酮类化合物
3
个，红花中黄酮类化合物
49
个，驱虫斑鸠菊和补骨脂中黄酮类化合物
49
个，整合去重转化为
Canonical SMILES
格式后共计
81
个。基于
admetSAR
方法，根据化合物吸收、代谢、分布、排泄等药动学参数筛选出
41
个成药性分子（评分
＞
0
）。其中根据稳定性原理将目标锁定在甲氧基黄酮类化合物山柰素和异鼠李素。见表
4
。
3.3
山柰素
、
异鼠李素与临床抗白癜风药物的结构聚类
通过
PubChem
数据库获得
21
个临床抗白癜风药物，与山柰素、异鼠李素一同转化为
Canonical SMILES
格式，进行结构聚类分析。结果显示，山柰素、异鼠李素结构相似度大于
0.9
，而山柰素、异鼠李素与甲氧沙林结构相似度大于
0.7
。见图
2
。
3.4
山柰素和异鼠李素对成年斑马鱼脱色素模型中黑色素的影响
550 nmol
/
L
新铜试剂处理成年斑马鱼
20 d
致使斑马鱼尾部皮肤横条纹黑色素完全脱失。建立好的成年斑马鱼脱色素模型给予甲氧沙林、异鼠李素、山柰素处理
3 d
。结果显示甲氧沙林、异鼠李素和山柰素均能够促进成年斑马鱼脱色素模型的黑色素再生，异鼠李素和山柰素效果优于甲氧沙林，见图
3-A
。斑马鱼皮肤冰冻组织切片结果显示甲氧沙林、异鼠李素和山柰素能够使斑马鱼皮肤横截面黑色素带延长，且成熟黑素体数量增加，见图
3-B
。通过斑马鱼皮肤黑色素含量测定结果显示，与对照组比较，山柰素、异鼠李素和甲氧沙林均能显著增加斑马鱼尾部皮肤中的黑色素含量（
P
＜
0.05
），见图
4
。
3.5
山柰素与异鼠李素对尾鳍再生实验中
MITF
、
Kita
和
DCT
表达的影响
斑马鱼断鳍再生后，给予甲氧沙林、异鼠李素、山柰素处理，见图
5-A
。结果显示第
1
阶段和第
2
阶段中甲氧沙林、异鼠李素和山柰素均能够促进斑马鱼尾鳍新生基质中的黑色素分化，这暗示了甲氧沙林、异鼠李素和山柰素均能促进鳍再生实验中黑色素细胞的早期分化标志物
MITF
、晚期分化标志物
Kita
和
DCT
的表达，见图
5-B
。
3.6
山柰素与异鼠李素对尾鳍再生实验中新生原基中黑色素的影响
斑马鱼断鳍再生后，给予甲氧沙林、异鼠李素、山柰素处理
10 d
，对新生原基进行冰冻组织切片，
见图
6-A
。结果显示药物处理后新生原基中成熟黑素体增加，这暗示了甲氧沙林、异鼠李素和山柰素均能使尾鳍新生原基中的成熟黑色素体增加，见图
6-B
。
3.7
山柰素
与
异鼠李素对斑马鱼幼鱼黑色素新生及胚胎存活率的影响
斑马鱼幼鱼给予甲氧沙林、异鼠李素、山柰素处理
72 h
，结果显示甲氧沙林、异鼠李素和山柰素均能够加速斑马鱼幼鱼眼部、背脊及腹部黑色素的新生，见图
7-A
。在给药处理
72 h
后，山柰素与异鼠李素对幼鱼的致死率小于
5%
，而甲氧沙林对斑马鱼幼鱼的致死率大于
5%
，小于
10%
，见图
7-B
。
3.8
山柰素与异鼠李素对斑马鱼幼鱼黑色素合成关键基因
MC1R
和
MITF
mRNA
水平的影响
山柰素、异鼠李素与甲氧沙林处理斑马鱼幼鱼
72 h
后，检测其
mRNA
水平的变化。
RT-PCR
凝胶电泳结果显示山柰素、异鼠李素和甲氧沙林能够显著上调
