二代测序已经问世十年了，最突出的特点就是通量的急剧增加和测序成本的急剧下降。现在1000美元即可完成个人的全基因组测序的目标已经实现了。但是很多人并不关心全基因的序列，只是关心部分基因序列或者区段，这样如何在测序前将这些区段富集就是一个研究的热点了，因此催生了测序前目标区段捕获的研究。
本人将介绍一下现在常用的目标区段捕获技术，这些技术主要分为三类:
hybridcapture（杂交捕获）,molecular inversion probes（分子倒置探针，MIP）和 PCR。
注：说明引物池的问题，因为有些科研人员是针对某个基因进行全测序，那么设计引物时相邻的引物是有over
1.
杂交捕获
杂交捕获的原理是人为设计探针（DNA或者RNA形式），探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性（一般是调节PH值到碱性）将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。
根据探针的状态不同，杂交捕获又因为杂交状况不同分为固态杂交和液态杂交。
A 固态杂交
：本质就是芯片，芯片上布满了探针，典型的是罗氏公司的NimbleGen。其特点是DNA探针，探针长度为50-105bp不等。其探针密度和序列都可以由研究人家自己设置（相对而言，针对一个区段的探针密度越大，其捕获成功率越高）。
B 液态杂交
：探针存在液相中。探针携带生物素，当探针和目标区段杂交完成后，通过磁珠可以将探针吸附（此时探针有携带目标区段的和空探针），将未被捕获的片段扔掉。之后通过变性可以将探针和目标区段分开，然后利用磁珠将所有空探针吸附丢弃，目标区段捕获完成。典型的是安捷伦公司的AgilentSureSelect技术，其探针是RNA探针，长度在120bp（illumina公司的illumina TrueSeq
探针为DNA，长度为95bp的液态探针）。
杂交捕获的优缺点：
杂交捕获最大的优点是捕获区段大，可以达到几百MB，远超PCR方案和MIP方案，同时根据探针的原理其均一性很好（均一性是评价捕获技术很关键的参数，均一性好后续测序成本就会下降）。但是杂交捕获的缺点也是明显，因为杂交前样本会被随机打断（一般认为500bp是比较合适的长度），探针捕获时可能和目的片段部分杂交，导致一些含有部分目标区段的片段被捕获。所以杂交捕获的特异性较差，容易捕获非目标区段。
2. MIP
MIP技术本质上是以连接-PCR反应捕获的技术，其优势是特异性好而且捕获完成后的片段直接完成了建库（杂交捕获后还需要构建测序文库，主要是添加index和测序接头）。其原理是设计一个口袋状探针，探针分为三部分（如上图），蓝色部分为通用序列（为后续构建文库所用），探针的5端和3端（彩色）能和目标区段退火，然后利用DNA聚合酶将探针缺口补齐，同时添加DNA连接酶，将缺口处磷酸二酯键连接，即可构成一个完整的环状探针。剩余未捕获探针和DNA序列通过外切酶消化（完整环状探针不受外切酶影响）。
完整的环状探针已近包含了目标区段序列。利用蓝色通用序列作为后续文库构建的引物（同时添加index和测序引物），扩增后产物可以直接作为二代测序文库。
MIP的有点是特异性好，捕获区段位于中游，高于PCR方案，但是低于杂交捕获方案。同时其缺点是捕获效率不高，有些区段难以设计探针和捕获。
3.PCR
PCR方案是本人的研究项目，同时PCR-目标区段捕获也是商业化应用最广泛的，因为什么呢！首先是便宜，不管引物的设计还是体系的价格都是最简单的，而且设计门槛低，不需要特殊的实验设计。相对于杂交捕获的花费（探针和杂交条件），多重PCR-目标区段捕获是极低的花费，而且适合大规模样本（这是本人研究多重PCR方案的关键，最适合大规模样本和少片段的富集。PCR富集手段实在太多，有长片段PCR，短片段PCR，乳液PCR，拯救PCR等等（都可以开个专题了），这里本人只介绍3种商业化的，经过市场验证的方案（这三种方案都是多重PCR）。
1） Ion Ampliseq（Thermo
FisherScientific）
Ion Ampliseq技术最关键的地方是引物设计，Thermo公司非常厉害，引物设计的人员实在太厉害（申请了专利），他们设计的引物可以满足1000-2000重单管反应不产生影响后续分析的引物二聚体和非特异产物。该方案就是你给需要捕获的序列，人家设计好引物池给你，你直接按照说明书做就好了。
备注：说明引物池的问题，因为有些科研人员是针对某个基因进行全测序，那么设计引物时相邻的引物是有overlap的（也是为了二代测序数据处理准确性，必须要有的），因此扩增时需要把相邻的引物分在两管内，防止相邻引物的上游和下游相互作用。
2）illumina TrueSeq（illumina）
该方案和MIP方案类似，也是以延伸-连接-PCR三部分组成的文库构建方案。针对目标区段设计两段探针（和引物长度一致18-21bp即可），探针和DNA双链中一条链杂交（两段探针杂交在一条链上），通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，将两探针间缺口补齐。上下游探针携带有通用序列，之后利用携带了通用序列的建库引物（携带index和测序引物）进行扩增后即完成了文库构建，可以直接用于后续二代测序。
3） 接力引物
该技术的核心是Ω引物，引物是分为三部分，从5-3端依次是5端序列、Ω环和3端序列，其中5端序列和3端序列是和目标区段互补的，但是Ω环不是，这个环首先是通用序列（用于后续文库构建），其次这个环保证了扩增的特异性，减少引物二聚体和非特异性扩增。
