单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用
杂交瘤技术
来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的
骨髓瘤细胞
融合为B细胞杂交瘤。
用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
1
简介
2
制备过程
3
抗原准备
4
动物免疫
5
细胞融合
6
杂交瘤细胞
7
鉴定实验
8
克隆化方法
9
细胞选择
10
应用
11
局限性
12
研究进展
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.
米尔斯坦
在自然杂交技术的基础上，创建立
杂交瘤技术
，他们把可在体外培养和大量增殖的
小鼠
骨髓瘤细胞与经
抗原
免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交
细胞系
，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个
细胞培养
，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、
氨基酸
顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。
这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新
抗原
;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫。
单克隆抗体制备流程
1、免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官
，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合
采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT
选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏
次黄嘌呤
-
鸟嘌呤
-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法
进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的
免疫球蛋白
类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
(1)体内诱生法：取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体制备流程
抗原，是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应
(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。
很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见
抗原
，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug
重组蛋白
、
偶联
多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。
动物免疫
单克隆抗体制备的宿主动物一般选用BALB/c小鼠，鼠单抗的应用范围相当广泛，一些国内外公司均开发出了兔的单克隆抗体制备技术。
免疫原分为可溶性抗原和颗粒性(细胞)抗原，用无菌盐水稀释并与佐剂混合，腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液，在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫。
周期第1天 采血0.2ml(获得0.1ml免疫前血清)；
第一次免疫(抗原加弗氏完全佐剂
)；
第14天 第二次免疫(抗原加弗氏不完全佐剂)；
第21天 采血和ELISA检测；
第35天 第三次免疫(抗原加弗氏不完全佐剂)；
第42天 采血和ELISA检测；
第56天 第四次免疫(抗原溶于
PBS
或盐水)；
第61天
细胞融合
。
(一)融合剂
细胞融合的方法有物理融合法（如电融合、激光融合），化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇
融合法。聚乙二醇(PEG)，在分子量为200-700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作
细胞融合
剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0-pH8.2(用10%NaHCO3调整)，分子量小的PEG，融合效应差，又有
毒性
，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%-50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同
批号
的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行
细胞毒性
试验后方可应用。要买高
纯度
的，一般选供气相色谱用的PEG。
(二)融合过程
融合的方法很多，常用的有转动法
和离心法。融合时脾细胞和
骨髓瘤细胞
的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。
1.试剂与材料
(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2)1640培养液100ml。
(3)完全1640液100ml。
(4)2.5%FCS-1640液50ml。
(5)HAT培养液100ml。
(6)50%PEG:取分子量4000，高纯度的(日本进口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培养盘。
2.操作方法
⑴准备好脾细胞；
⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS-1640液；
⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀；
⑷移去
上清液
；
⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把
沉淀管
放于40℃水浴中，使其达融合温度；
⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min；
⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min；
⑻重复⑺一次；
⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min；
⑽重复⑼一次；
⑾加1640液15ml；
⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀；
⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液；
⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的
细胞液
，每孔1滴(约0.05ml)；
⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育；
⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的
饲养细胞
；
⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用
倒置显微镜
观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10-20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体；
⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同时保存于
液氮
和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。
(三)细胞融合的关键
1.技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞
没有查到
免疫应答
。这必然要失败的。
2.融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个无毒无菌的操作环境。
克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性
的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠(无
胸腺
的裸鼠)，杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100-1000倍。
利用免疫抑制剂，如
降植烷
、液体
石蜡
、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。
大鼠神经胶质细胞株瘤杂交瘤细胞株
杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。
2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法
或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。
克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞
同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的
免疫性
强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3-5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括
有限稀释法
、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
(一)有限稀释法
1.材料
(1)微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞)。(2)HT
培养基
。
2.操作方法
(1)取出抗体阳性
孔细胞
，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。
(2)用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
(3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
(4)5%CO2饱和湿度，37℃培养。
(5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有
细胞生长
的孔。
(6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，测培养液抗体。
(7)抗体阳性孔细胞，移到有
饲养层
的组织
培养瓶
中，并传2-4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。
细胞
(二)软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下:
1.配2.5%的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2.将117ml完全DMEM液和3ml10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。
3.将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5%琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108脾细胞。
4.每块平皿加10ml，于室温中凝固。
5.DMEM中的细胞与DMEM-琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。
6.放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。
7.用PBS配制0.6%琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml25%羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml0.6%琼脂糖。
8.用3ml
琼脂糖
-羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h-2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。
(三)显微镜操作法
在直径6cm培养皿中，加入1ml1.0×108细胞悬液放置5%CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将
毛细管
口(一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长
乳胶
管，用口控制液体进入)水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104-5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。
(四)荧光激活分离法
用一种荧光激活细胞
分类器
(FACS)。其基本原理是:将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在
莱塞
光激发下，
荧光素
发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在
电场
中发生偏离，而分别收集于不同容器中。
(一)脾细胞
1.材料
(1)免疫过的血清抗体
滴度高的Balb/c鼠；
(2)1640培养液；
(3)2.5%FCS-1640
营养液
。
2.操作方法
(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。
(4)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。
(5)直立小试管3min，使大块的
结缔组织
下沉，把细胞悬液移入离心管中。
(6)以2.5%FCS-1640充满
离心管
，并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备
骨髓细胞
)。
(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。
(8)重复⑹、⑺步骤。
(9)计算细胞，以台盼兰染色用
相差显微镜
检查，活细胞数应高于80%为合格。
单克隆抗体制备流程
(二)
骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤
细胞融合
后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ
球蛋白
或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快，繁殖时间短。
(三)饲养细胞
在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。在
细胞融合
和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、
胸腺细胞
、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是
巨噬细胞
和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
