重磅 |原清华大学颜宁2018年发表第3篇Science（3篇系统总结）

电压门控钠（Nav）通道在产生膜兴奋性方面起着关键作用，并且是许多化学杀虫剂和人类药物的靶标。 Nav通道包含折叠成四个同源重复的一条单一多肽链（重复I-IV），每条重链包含六个称为S1-S6的跨膜螺旋。每次重复中的S1-S4区段构成电压感测区域（VSD），并且来自四个重复的S5，S6及其中间区段一起包围离子传导孔区域。

虽然小分子神经毒素如河豚毒素（TTX）和蛤蚌毒素（STX）起到孔隙阻滞剂的作用，但绝大多数肽类Nav通道毒素是门控修饰剂，通过与一个或多个相互作用，在通道周期的特定阶段捕获通道。与孔隙阻滞剂相反，门控调节剂毒素（GMTs）对Nav通道功能具有更复杂的变构效应，并且它们可以抑制或激活通道。 GMT通常比孔阻滞剂具有更高的选择性，是开发亚型选择性Nav通道药物的有价值的线索。

尽管对GMT调节Nav通道功能的分子基础进行了广泛研究，但尚未出现这种相互作用的共识模型。早期研究表明细胞外S3-S4环在GMT结合中起主导作用，但随后的研究揭示了S1-S2环在许多GMT相互作用中的关键作用。最近的研究表明，GMTs位于S1-S4螺旋之间的面向细胞外的空腔中，使它们成为阻碍电压传感器运动的楔形物。有人提出，大的GMTs，如在蝎毒液中发现的那些，可能能够同时接触VSD和连接孔螺旋P2和孔区域中的S6区段的细胞外环，但迄今为止没有研究预测到任何孔结构域膜螺旋在GMT结合中的作用。

阻塞Nav通道孔隙的小分子在动物毒液中很少见，但TTX和STX是例外。顾名思义，TTX最初是以河豚（河豚）为例的tetrodontoid鱼中发现的。数千年前在中国，埃及以及后来的日本和墨西哥记录了由于消费含有TTX的鱼而导致的河豚中毒。随后显示TTX存在于致命的蓝环章鱼，青蛙和蝾螈的有毒分泌物以及掠食性月亮蜗牛的毒液中; 这些动物不合成TTX，而是从内共生细菌中获取它 。在20世纪中期发现， TTX的强效毒性是由于通过特异性抑制Na +流入抑制动作电位产生。 STX是一种相关的胍鎓神经毒素，由海洋甲藻和蓝细菌产生，与TTX竞争结合Nav通道。

由于其对Nav通道的严格特异性，TTX和STX广泛用于Nav通道的药理学表征。哺乳动物Nav通道的九种亚型基于它们对TTX的易感性被分类为TTX抗性或TTX敏感性。后者受纳摩尔浓度的TTX抑制，而TTX抗性亚型Nav1.5，Nav1.8和Nav1.9仅响应微摩尔浓度的毒素。尽管在过去六十年进行了全面研究，但由于缺乏结构信息，大家对这些毒素作用机制的分子理解受到阻碍。已经阐明了几种细菌Nav通道的晶体结构，但这些同源四聚体原核生物直系同源物对TTX / STX不敏感，因为它们缺乏在其单链，不对称真核生物对应物中发现的受体位点。

原清华大学颜宁研究组，清华大学周强研究组及普林斯顿大学King合作，以3.8Å的分辨率（34）阐明了美洲蟑螂美洲大蠊（Periplaneta americana）的真核Nav通道NavPaS的结构。在这里，颜宁等研究组展示了该通道的2.8Å分辨率cryo-EM结构与Dc1a的复合物，Dc1a是来自沙漠丛蜘蛛Diguetia的毒液的肽GMT，可以促进德国蟑螂通道打开Nav通道。颜宁等研究组还报告了NavPaS-Dc1a复合物在孔隙阻滞剂TTX和STX存在下的冷冻-EM结构，分别为2.6Å和3.2Å。观察到由三个羧酸酯基团构成的选择性过滤器（SF）中的Na +结合位点。该结构阐明了TTX / STX对孔隙阻滞的分子基础。

在果蝇和脊椎动物中广泛研究的Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎发生和出生后组织维持和再生中起着关键作用。 Hh信号的激活通过分泌蛋白Hh与Hh响应细胞中的膜包埋受体Patched（Ptch）结合来启动。在缺乏Hh的情况下，Ptch抑制Smoothened（Smo，F类GPCR），但机制尚不清楚。 Hh与Ptch的结合减轻了Smo的抑制作用，并开启导致Hh通路转录激活的信号事件。受损的Hh途径活性可能导致出生缺陷，而通过抑制Ptch或激活Smo而异常活化Hh信号传导已牵涉到几种组织的肿瘤发生，例如基底细胞癌和成神经管细胞瘤。

在哺乳动物中，已经鉴定出三个Hh同系物，即Sonic（Shh），Desert（Dhh）和Indian（Ihh），其中Shh代表功能和机理解释的原型。约450个残基的Shh前体经历自催化切割并产生〜20kDa的氨基末端结构域（ShhN），其负责所有已知的信号传导活性。 ShhN用N末端棕榈酰基和C末端胆固醇基部分修饰。尽管未分离的ShhN表现出降低的活性，但这些修饰对于与Ptch的高亲和力结合是不必要的。

由于Hh途径的异常激活与肿瘤发生相关，已经开发了靶向Hh信号传导的不同类型的抑制剂。虽然它们中的大多数是Smo的拮抗剂或Hh途径中下游组分的抑制剂，但一些（例如Robotnikinin和HL2-m5大环肽）被设计为破坏Ptch1和ShhN之间的相互作用。有关ShhN / Ptch1复合物的结构信息可能为设计或优化配体以破坏ShhN和Ptch1之间的复合物形成提供重要见解。虽然已经报道了许多单独的ShhN片段的晶体结构和与不同的结合蛋白复合的晶体结构，但没有关于Ptch的结构信息。

Patched（ptc）克隆为果蝇中的片段模式基因。后来人类同系物被确定为基底细胞痣综合征（也称为戈林综合征）的肿瘤抑制基因。在哺乳动物中存在两种Ptch同源物，Ptch1和Ptch2，尽管它们具有不同的表达模式和生理功能，但它们以相似的亲和力与三种类型的哺乳动物Hh配体结合。据预测，由1447个氨基酸组成的全长人Ptch1（hPtch1）含有12个跨膜片段（TM），两个胞外结构域（ECD）和两个胞内结构域。 Ptch蛋白与质子驱动的多药耐药泵AcrB所示的细菌耐药结瘤分裂（RND）家族转运蛋白具有序列相似性。 TMch 2-6的Ptch构成固醇感受域（SSD），已经发现在许多固醇运输和代谢相关蛋白中，例如3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶（HMGCR），SREBP裂解活化蛋白质（SCAP），Niemann-Pick型C1（NPC1），NPC1样1（NPC1L1）和另一个Hh信号组件Disp。虽然人类NPC1的结构最近已被确定，但由含SSD的蛋白质介导的潜在固醇结合或运输的分子机制仍然是神秘的。

在这里，原清华大学颜宁研究组分别报告了人类Ptch1的和与ShhN复合物的整体分辨率分别为3.9Å和3.6Å的冷冻电镜结构。这些结构揭示了ShhN和Ptch1之间的详细认识。出乎意料的是，观察到两个类固醇分子，一个位于由ECD域包围的袋中，另一个位于SSD的面向膜的腔中。结构指导的生物化学分析表明ShhN和Ptch1之间的相互作用是类固醇依赖的，观察结果证实了额外的结构证据。