肿瘤精准细胞免疫治疗：梦想照进现实

自2015年1月20日美国总统奥巴马高调宣布启动“精准医疗计划（Precision Medicine Initiative）”以来，全球范围内掀起一股精准医疗热。在国内，精准医疗也风生水起，受到业内学者、药企代表、患者等相关人群的广泛关注。精准医疗本质上是一种更为精确的个性化医疗，非常适用于恶性肿瘤的临床治疗。而相对于其他精准医疗策略，精准细胞免疫治疗（precision cell immunotherapy，PCIT）具有开发周期相对较短、投入相对较低的优势，适合我国的国情，具有巨大的应用前景，有望成为我国恶性肿瘤精准医疗的一大突破口。

精准医疗是肿瘤临床治疗的必然趋势 精准医疗（precision medicine）是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对疾病进行精细分类及精确诊断，从而对疾病和特定患者进行个性化精准疗的新型医学概念与医疗模式。2011年，在“人类基因组计划”完成近10年后，这一概念由美国著名基因组学家Olson博士在其参与起草的美国国家智库报告《走向精准医疗》中首次提出。精准医疗模式集合了诸多现代医学科技发展的知识与技术体系，体现了医学科学发展趋势，也代表了临床实践发展的方向，将带来一场新的医疗革命并将深刻响未来医疗模式。正是基于此考虑，2015年1月20日，美国总统奥巴马在白宫高调宣布启动“精准医疗计划”，拟通过分析100万名志愿者的基因信息，研究遗传性变异在疾病发生发展中的作用，了解疾病治疗的分子基础，为药物研发与患者“精准治疗”明确方向，以推动个性化医疗的发展，并希望以此“引领一个医学新时代”。

在美国提出的精准医疗计划中，恶性肿瘤的精准医疗是“重中之重”。美国国立卫生研究院下设的国家癌症研究所，将接受重点资助开展解码肿瘤基因及开发精准治疗研究。那么，为什么要从肿瘤着手开展精准医疗计划呢？诚然，这与当前日趋严峻的肿瘤防治形势相关，另一个重要的原因是提升 肿瘤疗效的迫切需求。众所周知，肿瘤本质上是一种由一系列基因变异的积累导致的复杂遗传疾病，这意味着肿瘤的基因组是动态变化的，且存在着高度异质性。不同的疾病进展阶段以及不同的肿瘤细胞可能携带不同的变异信息，从而对以大规模人群为基础开发和测试药物的治疗模式构成了颠覆性挑战。据一项覆盖9个国家和地区的1217例患者的泛亚洲科研显示：如果没有基因检测鉴定相关的靶标却接受了靶向治疗，死亡风险将增加185%。 而新一代测序技术能够无假设、高分辨率地分析基因组，获知这些不同的变异信息，能为制定更具针对性和有效性的防治措施提供准确依据，指导医生对患者采取个性化用药。基于上述原因，精准医疗模式已然成为癌症治疗刻不容缓的任务，是恶性肿瘤治疗的大势所趋。

在具体操作中，肿瘤精准医疗通常可划分为以下三部曲：基因检测，大数据分析和用药指导。第一步，基因检测是患者变异信息的获知过程，如通过高通量测序方法获得肿瘤单核苷酸有义突变、拷贝数变异、基因移位和融合基因等海量基因变异信息，该环节中相关检测技术的精确性及所检测对象（如肿瘤组织标本）所反映信息的全面性是关键。第二步，大数据分析是相关变异信息的解码与提炼过程，即从海量的组学数据中抽丝剥茧、去粗存精，提取有 价值信息，发挥前后两个环节之间承上启下的作用，该环节相应分析模型与分析方法的精确性是关键。第三步，用药指导是以大数据分析结果作为参考，制定因人因病而异的治疗方案的过程；而治疗的结果也可以反馈到第一个环节，通过新的环路保证治疗能随病情的变化而做出相应的调整。候选药物可涵盖所有类型恶性肿瘤临床用药，甚至用于其他疾病治疗的药物。该环节中，可供选择的治疗药物的丰富度直接关系到实施精准医疗治疗的成败。

精准医疗直指恶性肿瘤临床治疗的软肋，其好处不言而喻，已在临床治疗中越来越显现其价值。 然而，每个患者多个癌细胞在癌变过程中与之相关的基因突变位点有成千上万处，而其中起决定性作用的基因突变往往不足十处，如何从每个患者成千上万处体细胞突变中找到每个肿瘤细胞真正的阿喀琉斯之踵，即引发癌变的关键基因，并非是一件容易的事；由于肿瘤的异质性，同一肿瘤患者不同癌细胞的基因突变并不一定相同，不同关键基因突变的随机组合，导致癌症治疗难度大为增加；更为严重的事是癌症细胞周期检查点已破坏，各种新突变及融合基因仍在不断累积，这些新突变及融合基因可能会破坏这些靶向药物的靶点及其下游信号，从而使靶向治疗药物失效。因此，看似已抑制了关键基因，但癌症细胞又建立新的关键基因并产生旁路。按精准医学模式，希望将癌症变为一种慢性病，但从发现靶点—使用靶向药物—靶点突变或建立新旁路—癌症复发—寻找新靶点—使用新靶向药物，这种反复的猫捉老鼠的游戏，传统药物开发手段难以开发满足所有变异信息的治疗药物，同时肿瘤基因突变的速度可导致费尽心思寻找到的药物在几个月时间内失效，患者只能辗转于不同药物的变换，对患者家庭乃至整个医疗保险体系造成巨大经济负担。肿瘤精准医疗的这一系统性缺陷应值得引起充分的重视。

精准细胞免疫治疗是肿瘤精准医疗的重要突破口

人类的免疫系统具有高度的特异性，能正确区分 正常和恶性细胞，能以高度的敏感性和特异性识别 “非自我的”分子或细胞，功能正常的T淋巴细胞能 通过其细胞表面TCR受体（T cell receptor）正确识别 肿瘤细胞中“非自我”改变，清除肿瘤细胞。因而，从 这个意义上说，通过激活、修复、改构、甚至重建患者 抗肿瘤免疫细胞反应的治疗方法，尤其肿瘤细胞免疫 治疗，天然具有精准治疗的特征。通过激活患者体内 残存肿瘤特异性T细胞的治疗方式，已被证实具有良 好的临床疗效。更值得庆幸的是，不同T细胞所 携带的TCR受体千差万别，具有高度的多样性，为实 施针对不同肿瘤变异信息的精准医学治疗提供了足 够的广度。而且，免疫细胞来源于患者自体，作为一 种“活的药物”，具有自主性与自我适应能力，能有效 缩短开发时间。因而，精准细胞免疫治疗有望成为 肿瘤精准医疗的一个重要突破口。

本文定义的精准细胞免疫治疗是通过高通量基 因测序及大数据分析，获得针对癌细胞特异性新抗 原（neo-antigens）和具有高效应的精准T细胞（precision T cell for neoantigen，简称为PNA-T），富集 PNA-T细胞对肿瘤患者进行精准免疫治疗。涉及的 步骤（图1）包括：（1）基因检测：高通量基因检测手 段获取患者的癌细胞特有的基因变异信息（包括突 变、融合基因等），从中筛选出能高效激活免疫反应 的肿瘤特异性新抗原，这种新抗原可以来自细胞核、 细胞质、细胞膜任何部位；（2）免疫靶点的筛选：根 据患者的主要组织相容性复合体（major histocom patibility complex，MHC）分型，寻找能引发强烈免疫 的新表位（neo-epitopes）；（3）寻找并富集针对新抗 原表位的PNA-T细胞：主要通过负载新表位的树突 状细胞（dendritic cells，DC）刺激，标记后的MHC-新 表位耦联体流式/磁珠分选富集PNA-T细胞，克隆 PNA-T细胞的TCR基因，通过转基因修饰手段快速 获得转基因PNA-T细胞；（4）过继细胞回输治疗：大 量扩增PNA-T细胞，实施过继回输治疗，并跟踪 PNA-T细胞的变化规律与肿瘤关系。因而，肿瘤精 准细胞免疫治疗是更为个性化的免疫细胞治疗技 术，属于第三代免疫细胞治疗技术（三代免疫细胞 治疗技术的比较见表）。

虽然肿瘤精准细胞免疫治疗是一个新概念，但 该领域内研究者已进行了一些探索研究。 2013年，rosenberg领导的团队率先采用外显子测 序技术，鉴别在患者中表达的突变蛋白，并用一种 MHC分子-抗原表位亲和力算法进行模拟预测评 估，进而合成候选的抗原表位，开展免疫反应验证。 通过此方法，研究人员能快速鉴别出了在患者肿瘤 细胞上表达，能被肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）识 别 的 突 变 抗 原 。2014 年，Rosenberg团队将该方法成功应用到临床，他们 通过高深度外显子测序技术、免疫反应功能验证，筛 选出一位转移性胆管癌患者的高频突变基因，并鉴 定到其对应的TIL克隆，通过大量扩增该TIL克隆 并实施回输治疗，使患者的病情得到有效控制。 2014年底，另一个研究团队联合应用外显子测序技 术、转录组测序技术、高通量蛋白质谱分析技术，及 MHC分子-抗原表位亲和力模拟预测技术，寻找到 能被T细胞识别从而高效激活免疫反应的多肽疫 苗，该个性化肿瘤疫苗兼具预防性疫苗与治疗性疫 苗的效能。笔者研究团队作为全国第一家获得 细胞治疗应用批文的单位，对精准医疗在免疫细胞 治疗方向中应用的重要性具有深刻的体会，前瞻性 地开展了精准细胞免疫治疗的技术开发，搭建了高 通量测序平台，采用了患者循环肿瘤细胞的富集与 单细胞分离技术、免疫新靶点的生物信息学筛选技 术等，为实施精准细胞免疫治疗打下坚实的基础。

精准细胞免疫治疗的大致流程

CTC:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell)；ctDNA:循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA);MHC:主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)

三代免疫细胞治疗技术的比较

肿瘤精准细胞免疫治疗面临的技术难点

如前所述，免疫治疗的理想靶点具有区别于其 他靶向治疗策略的特征：小分子靶向药物注重的是 能有效干预对肿瘤细胞生长、侵袭、转移等细胞行为 至关重要的基因及调控通路，而细胞免疫治疗的关 注点是其能否有效地被免疫系统识别，引起有效的 免疫反应。所以，同样从基因检测出发，精准细胞免 疫治疗的侧重点具有其特殊性，目前仍有几大技术 难题亟待解决。

方便快速地获取肿瘤患者的基因组变异信息

实际上，这是肿瘤基因检测所面临的共性问题。 肿瘤基因检测最直接的对象是患者原代组织标本， 但对于那些未进行过手术的肿瘤患者，肿瘤标本不 易获取，而活检穿刺的技术虽已较为成熟，但患者接 受度相对较低，尤其对那些已发生多处转移的患者。 即便之前留有标本，但往往是几个月前甚至是几年 前保存的局部标本，鉴于肿瘤基因组的动态性与异 质性，它们反映的信息已经是过时的或者代表的信 息不全。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)由 肿瘤发生的各个部位释放入血，能良好地反映患者 整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基 因突变信息。因而，选择CTC和ctDNA作为基 因检测的样品来源，可以保证肿瘤治疗在取样信息 上的全面精准，且与组织活检相比具有检查微创小、 无放射性污染、经济等优点，并允许对治疗反应进行 实时监测。

然而，如何获取高纯度的CTC细胞并进行基因 测序，以及如何在外周血巨大噪音背景的情况下准 确检测ctDNA是一项具有挑战的工作。笔者研究 团队通过分离介质、抗体捕获、荧光扫描显微技术、 激光显微捕获等整合技术平台可以高效获得单个CTC细胞用于基因检测；同时开发了通过油滴PCR实现在一个油滴内单个CTC基因检测技术，以及利 用纳米孔径的芯片进行ctDNA的肿瘤突变基因检 测技术。发展类似于CAPP-Seq的超灵敏测序方 法，可以实现100%地检出2~4期NSCLC患者50%的ctDNA，可以特异性（96%）检出等位基因突变，并将错 误率降低至约0.02%水平。这类技术平台有望利 用CTC和ctDNA进行外周血肿瘤基因的精准检测， 为精准细胞免疫治疗提供可靠的检测依据。