2025年1月31日，Science期刊在线发表了题为Casz1 is required for both inner hair cell fate stabilization and outer hair cell survival的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘志勇研究组完成。该项研究报道了锌指转录因子Casz1在听觉毛细胞（hair cell, HC）命运稳定与生存维持中的双重作用，并解析了Casz1发挥功能的分子机制，为探索基因操纵修复听觉损伤提供了新的思路和靶点。
哺乳动物的声音感知依赖于耳蜗中的两类HC：内毛细胞（inner hair cell, IHC）和外毛细胞（outer hair cell, OHC）。它们顶部都具有纤毛结构，声音振动使纤毛发生偏转并激活OHC和IHC（图1）。其中OHC通过改变其细胞长度以发挥声音放大器的作用，IHC则是主要的声音感受细胞，与螺旋神经节形成突触连接。全球约有1/5人群受到不同程度听力损伤，由遗传突变、噪音及耳毒性药物等导致的HC死亡是感音性耳聋的重要因素之一。然而，哺乳类动物包括人类不具备再生修复HC的能力。因此，深入研究OHC和IHC命运决定和维持存活的分子机制，对帮助耳聋患者恢复听觉功能具有重要的临床意义。
图1耳蜗听觉上皮柯蒂式器（Organ of Corti）及纤毛结构
（A）耳蜗柯蒂式器包含一排IHC和三排OHC及多种类型的支持细胞。（B）小鼠耳蜗HC扫描电子显微镜纤毛结构，OHC的纤毛（紫色）呈现V或W型，IHC的纤毛（蓝色）呈现“一”字形。
近年来的研究发现， Tbx2是IHC命运决定、分化和命运维持的关键转录因子，而Insm1和Ikzf2对于OHC的命运维持、存活和功能至关重要。然而，耳蜗前体细胞最终如何发育为OHC和IHC的精确基因调控网络还知之甚少。例如，是否存在一类基因能够同时调控IHC和OHC的命运稳定和存活尚不清楚。刘志勇研究团队通过分析OHC和IHC的显著差异表达基因，发现了一个物种间保守的锌指转录因子Casz1。其在胚胎晚期直至成年IHC中一直高表达，但只在胚胎晚期和幼年期OHC中瞬时表达（图2左）。研究团队通过系统性分析条件性Casz1敲除小鼠，发现在胚胎期缺失Casz1后，IHC可以正常产生，但其细胞命运状态变的不稳定，开始表达OHC基因 (例如Prestin) 并逐步下调IHC基因 (例如vGlut3)，最终完成IHC向OHC的命运转变，产生一类外毛细胞样细胞（induced OHC like cells，iOHCs）。另外研究人员发现，出生后条件性敲除Casz1，IHC的发育不受影响或者影响甚微，这表明Casz1的核心作用在于胚胎阶段，它如同“守护者”一般，确保IHC的命运不偏离轨道，防止其转变为OHC（图2右）。然而，在 OHC 中，Casz1扮演的角色截然不同，其主要任务是维持OHC存活。尽管失去Casz1的OHC 依然能够完成早期发育，但随着小鼠成长至成年，这些细胞会不可避免地开始死亡。由于OHC和IHC的异常，条件性Casz1敲除小鼠最终表现出严重的听力障碍。
图2 Casz1在耳蜗HC发育中的表达特征及其功能
（左）Casz1在耳蜗HC中的表达模式。（右）Casz1早期条件性敲除导致IHC逐步转化为iOHCs，以耳蜗顶部为例，有67.3%的IHC发生转变。iOHC表达OHC分子标记物Prestin，而下调IHC分子标记物vGlut3。
为了深入探究Casz1调控HC发育的分子机制，研究团队借助全长单细胞转录组分析技术，对缺失Casz1后OHC和IHC的基因表达变化进行了全面解析。进一步通过遗传学回补实验确认了转录因子Gata3是Casz1的重要下游效应分子。Gata3在Casz1-/- IHC中显著下降，在Casz1-/- 小鼠中回补Gata3, 可以有效抑制Casz1-/- IHC的异常和缓解OHC的死亡表型，最终实现Casz1-/-小鼠听觉功能的部分恢复（图3）。由于Tbx2被报道在IHC分化中发挥重要作用，而Insm1被报道在OHC分化早期发挥作用，研究团队进一步通过小鼠体内遗传学实验证明了Tbx2对Casz1发挥上位（epistatic）调控作用，过表达Tbx2能彻底阻止Casz1-/- IHC向OHC转分化。另外，作者也证明了Casz1-/- IHC向OHC转变的过程并不依赖于Insm1，提示Casz1敲除介导的IHC向OHC的转分化过程并不一定要完全重复OHC正常的发育轨迹。综上，刘志勇研究团队通过单细胞转录组、电生理记录、电镜、细胞功能分析和小鼠遗传学模型等技术首次解析了Casz1在听觉HC中的双重作用，揭示了Tbx2-Casz1-Gata3转录调控通路参与早期IHC的命运稳定，也发现了Casz1在纤毛发育和OHC存活中不可或缺的作用（图3）。该研究成果不仅为基础听觉科学研究领域增添了重要一环，也为未来促进HC再生及纤毛功能恢复提供了潜在基因靶点，将有望推动听觉毛细胞损伤基因治疗领域的发展，为听力障碍患者带来福音。
图3 耳蜗HC发育的基因调控机制示意图
缺失Casz1导致IHC转分化为iOHC并伴随OHC死亡。Gata3作为Casz1的下游效应分子，其过表达可缓解Casz1缺失引起的HC异常，并部分恢复小鼠听力。Tbx2通过上位调节 Casz1促进IHC基因表达并抑制OHC基因表达，同时Casz1也可能间接调控Tbx2表达。中科院脑智卓越中心刘志勇研究员为该研究的通讯作者，脑智卓越中心博士后孙雨薇为该论文的第一作者，博士生任旻蕙对转录组分析做出了重要贡献，博士生罗正南、孙素红、王广琴和副高级实验师贺顺姬对小鼠构建做出了重要贡献。博士生李书亭、张迪协助单细胞转录组的湿实验和分析。上海交通大学第九人民医院宋雷研究员及博士生张宇参与了OHC非线性膜电容分析，美国University of Utah (犹他大学) 人类遗传学系的Suzanne L Mansour教授提供了重要的转基因动物并协助论文撰写和修改。
听觉作为人类五感之一，是我们感知世界的重要途径之一。它不仅让我们能够聆听音乐、与他人交流，更是维系社交、学习和安全的重要能力。听力损伤会严重影响人类健康和日常生活，根据世界卫生组织（WHO）的调查，全球有超过15亿人患有不同程度的听力损伤。噪音、药物毒性、衰老、遗传突变是影响听力的主要因素，其耳毒性主要作用于耳蜗毛细胞并最终使其死亡。耳蜗的两类毛细胞负责感知和解码外界的声音信息，其中外毛细胞是声音放大器，而内毛细胞是主要的声音感受细胞。当毛细胞损伤后，非哺乳类动物（如鸟类和鱼类）能够通过支持细胞的转分化再生出新的、有功能的毛细胞，从而恢复听力功能。然而，哺乳类动物却丧失了这一再生能力。研究表明，在鸟类和鱼类中，支持细胞在转分化为毛细胞的过程中，会重新激活毛细胞发育过程中的关键基因，其中最为重要的基因之一是Atoh1。1999年美国贝勒医学院的Huda Zoghbi教授团队证明Atoh1对于毛细胞的产生是必须的【1】。我的团队于2000年证明Atoh1过表达可以诱导异位毛细胞的产生【2】。这些研究揭示了毛细胞发育基因在听力功能重塑中的潜力，表明解析发育过程的分子机制是实现哺乳类动物听觉再生的重要突破口。目前哺乳类动物毛细胞再生领域的最大障碍是新产生的毛细胞发育不完全，特别是其顶部的纤毛发育异常，这也是当前在耳聋小鼠模型中无法实现听力恢复的核心障碍之一 【3,4】。
近年来外毛细胞和内毛细胞命运选择的机制研究取得了重大的进展。2018年, 美国西北大学的Jaime García-Añoveros教授发现了Insm1对于维持早期外毛细胞的细胞命运至关重要【5】，美国马里兰大学/国立卫生研究院的Ronna Hertzano教授和英国MRC/伦敦大学学院的Michael Bowl教授发现Ikzf2 对于维持晚期外毛细胞的细胞命运有着重要的作用【6】。2023年中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）的刘志勇研究员证明了Insm1和Ikzf2的基因层级调控关系【7】。2022年美国西北大学的Jaime García-Añoveros教授，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘志勇研究员和德国汉诺威医学中心的Mark-Oliver Trowe和Andreas Kispert教授等三个研究团队，同时鉴定出内毛细胞命运决定的核心基因Tbx2【8-10】。这些研究暗示外毛细胞和内毛细胞的发育是由两套独立的基因或者信号通路调控。
在本研究中，刘志勇研究员团队通过分析内毛细胞和外毛细胞在单细胞转录组水平上的显著差异表达基因，发现了锌指转录因子Casz1：一个果蝇Castor的同源基因，也是一个在细胞功能和命运决定中具有重要作用的古老基因，但其在耳蜗毛细胞中的功能仍然未知。刘志勇研究团队通过单细胞转录组、电生理记录、电镜、细胞功能分析和构建小鼠遗传学模型等多种技术手段，首次解析了Casz1在听觉毛细胞中的双重作用：它不仅能保障内毛细胞的命运和功能稳定，还参与维持外毛细胞的存活和纤毛形态。在进一步的研究中，该团队深入解析了Casz1发挥功能的分子机制，找到了Casz1的核心下游效应因子Gata3，并提示了Tbx2对Casz1的上位调控作用。作为一次对毛细胞发育基因调控网络的重要探索，这无疑是听觉基础科学研究的一项重要进展，同时，这一成果也为听觉毛细胞再生及纤毛功能修复指明了新的方向，并为听觉毛细胞损伤的基因治疗提供了潜在靶点，有望为听力障碍患者带来全新的治疗策略和希望。
参考文献：
1. N. A. Bermingham et al., Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science 284, 1837-1841 (1999).2. J. L. Zheng, W. Q. Gao, Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci 3, 580-586 (2000).3. S. Sun et al., Dual expression of Atoh1 and Ikzf2 promotes transformation of adult cochlear supporting cells into outer hair cells. Elife 10, (2021).4. X. Li et al., In situ regeneration of inner hair cells in the damaged cochlea by temporally regulated co-expression of Atoh1 and Tbx2. Development 150, (2023).5. T. Wiwatpanit et al., Trans-differentiation of outer hair cells into inner hair cells in the absence of INSM1. Nature 563, 691-695 (2018).6. L. Chessum et al., Helios is a key transcriptional regulator of outer hair cell maturation. Nature 563, 696-700 (2018).7. S. Li, S. He, Y. Lu, S. Jia, Z. Liu, Epistatic genetic interactions between Insm1 and Ikzf2 during cochlear outer hair cell development. Cell Rep 42, 112504 (2023).8. Z. Bi et al., Development and transdifferentiation into inner hair cells require Tbx2. Natl Sci Rev 9, nwac156 (2022).9. J. Garcia-Anoveros et al., Tbx2 is a master regulator of inner versus outer hair cell differentiation. Nature 605, 298-303 (2022).10. M. Kaiser et al., TBX2 specifies and maintains inner hair and supporting cell fate in the Organ of Corti. Nat Commun 13, 7628 (2022).http://doi.org/10.1126/science.ado4930制版人：十一
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