的BioArt按：基因印迹（genomic imprinting）是一个经典的表观遗传现象，是指子代中某些特殊位点的基因仅表达来自父源或母源的等位基因，而对应的另一个等位基因表现为转录沉默。目前关于调控基因印迹的分子机制的研究主要认为与等位基因调控区的差异性DNA甲基化以及某些长链非编码RNA的参与有关。然而是否还存在其它调控基因印迹的新机制，目前尚未有明确报道。7月19日，哈佛医学院张毅教授课题组在Nature杂志上以长文形式（Article）发表了题为“Maternal H3K27me3 controls DNA methylation-independent genomic imprinting”的重量级研究论文，首次证明了DNA甲基化以外的另一种重要的表观遗传修饰H3K27me3调控某些印迹基因发生的分子机制。这一成果对进一步完善基因印迹发生的机理具有重要的意义，是基因印迹领域具有里程碑式意义的发现，这一原创性发现也将会写进表观遗传学相关的教科书中。鉴于该成果的重要意义，BioArt特别邀请到了杰出的表观遗传学家、中科院生物物理所朱冰研究员做精彩点评，以飨读者！
论文解读：
众所周知，哺乳动物是二倍体，在哺乳动物中绝大部分等位基因不管是来自父源还是母源基本上都会同时表达或者关闭。然而，从上个世纪90年代起，科学家陆陆续续发现了一系列特殊的基因，其父源或者母源的等位基因的表达存在差异，而这种基因差异表达的调控主要受表观遗传调控，这类基因称之为印迹基因（ imprinting gene），这种表观遗传学现象被称为基因印迹（genomic imprinting）【1】。（BioArt温馨提示：有关基因印迹的相关详细内容，请阅读Denise P. Barlow和 Marisa S. Bartolomei 2014年发表在Cold Spring Harbor perspectives in biology上的综述论文“Genomic Imprinting in Mammals”，该文也收录在David Allis主编的第二版《Epigenetics》教材中。）
基因印迹并非存在所有的真核生物中，从目前的研究来看主要存在于哺乳动物、昆虫和少数植物中（例如玉米和拟南芥）【1】。1984年，来自美国Wistar研究所的科学家JamesMcGrath和DavorSolter在Cell上发表文章，通过核移植实验证明了只有同时具备双亲染色体的胚胎才能存活，而含有两份父源基因组（biparental gynogenones）或者两份母源基因组（biparental androgenones）的胚胎则不能完成正常的胚胎发育，这表明父源和母源基因组对于胚胎发育的贡献存在较大的差异性【2】。无独有偶，差不多同一时期来自英国剑桥的科学家Azim Surani（BioArt注：北京大学汤富酬教授的博士后导师）等人也发现了类似的现象，并首次提出了基因印迹这一重要表观遗传学概念（他在Nature论文中写道，“We propose that specific imprinting of the genome occurs during gametogenesis so that the presence of both a male and a female pronucleus is essential in an egg for full-term development”）【3】。
自1991年3个重要重要的印迹基因Igf2、Igf2r和 H19差不多在同一时期被不同的实验室报道以来【4,5,6】，目前在人类和小鼠中已经发现了大约150个印迹基因（下图）【7】。
小鼠染色体上印迹基因的分布图。 红色表示母源表达基因， 蓝色表示父源表达基因。图片引自http://www.har.mrc.ac.uk/research/genomic_imprinting
此后随着对印迹基因的深入研究发现，许多基因的印迹表达是由不同亲本来源的等位基因调控区的差异性DNA甲基化（differentially methylated region， DMR）造成的，而且印迹基因大多以基因簇的形式存在，目前所有已知的印迹基因簇中都至少包含 1～2 个 长链非 编 码 RNA【8】。
尽管 DNA 甲基化的差异在基因印迹的建立和维持过程中具有重要作用，然而也有一些研究表明纯粹的DNA甲基化差异调控并不足以解释某些基因印迹的发生，特别是最近有报道表明有些印迹基因的产生并不依赖与DNA的甲基化【9，10】，这表明可能还有其它的表观遗传机制参与其中。尽管过去有研究表明包括H3K27me3在内的组蛋白修饰与印迹基因的产生有一定的相关性，然而这些印迹基因的位点都与临近的差异性DNA甲基化区域存在一定的关联【11】。因此，发现不依赖于DNA甲基化的基因印迹新机制具有十分重要的意义。
在这篇文章里，张毅实验室的工作证明亲本基因组上差异组蛋白上H3K27me3修饰是一个新的基因印迹的调控机制。事实上，这项研究是基于该课题组去年在Cell上发表的一项工作，在该项工作里张毅实验室开发了一个用少量细胞进行DNase I超敏感位点（DHS）全基因组谱测序分析的liDNase-seq技术【12】。由于精子DNA通过缠绕在精蛋白上致密包装，因此精子和卵子细胞中染色质上DHS位点差异非常大，研究人员发现在小鼠受精后母源染色质上DHS很大程度上继承了卵子中的状态，而父源染色质上DHS很快（7小时内）已经被重编程成类似于母源染色质的状态。虽然亲本之间整体水平上已经很像，但是在某些位点仍然存在明显的亲本特异性。这其中包括一些已知的印迹基因位点（下图）【12】。
在这篇新的研究中，研究人员从1细胞期小鼠胚胎中物理分离了母原核与父原核，并对其通过liDNase-seq技术分析了高分辨率的父本以及母本的DHS，从而鉴定了数百个亲本特异的DHS位点。这些位点包含了很多已知的基因印迹控制区域。例如很多母源印迹基因印迹控制区域只在父源染色质存在DHS，而母源染色质中没有。因此，研究人员猜测其它亲本特异的DHS位点可能包含新的基因印记控制区域。因为小鼠胚胎转录激活从二细胞期开始，因此通过分析二细胞期亲本特异的转录激活，研究人员证明多数亲本特异激活的基因在启动子区域存在亲本特异的DHS，从而暗示这些基因可能是新的印迹基因。
因为早先的研究表明DNA甲基化是哺乳动物中基因印迹建立唯一已知机理，因此接下来为了研究这些亲本特异DHS建立的机理，研究人员观测了这些区域的DNA甲基化状态。研究发现这些DHS区域只有部分在没有DHS的亲本中表现出高DNA甲基化，而很多区域既没有DHS也没有DNA甲基化。因此研究人员猜测在这些区域可能存在其他表观遗传修饰阻碍DHS的建立。
DNA甲基化之外已知的主要参与转录抑制的染色质修饰包括组蛋白上H3K27me3和H3K9me3两种修饰，因此研究人员尝试通过过表达相应的去甲基化酶Kdm6b和Kdm4d去除这些修饰看哪些位点的差异DHS受这些修饰影响。结果表明有几十个亲本特异DHS受H3K27me3去除的影响，同时这些DHS在被沉默的位置基本没有DNA甲基化发生。这表明在不依赖于DNA甲基化的亲本特异DHS区域H3K27me3控制了这些区域的关闭。
这些一细胞期新鉴定的亲本特异DHS一方面可能是新的候选印迹基因控制区域，另一方面可能只是短期内还没有完成的重编程过程的中间状态区域。因此接下来研究人员查看了这些位点是否可以随着发育的进行被保留下去。为了进行高分辨率的亲本特异DHS鉴定，研究人员通过一细胞期雌雄原核交换构建了只有父源染色质的孤雄胚胎（AG）与只有母源染色质的孤雌胚胎（PG）。这些胚胎可能进行正常的着床前发育。通过对AG和PG桑椹胚时期的DHS分析研究人员发现了247个父源（AG）特异的DHS，这其中有105个落在母源没有DNA甲基化并且有母源特异H3K27me3的区域并且这些表观遗传状态是从1细胞期遗传到了桑椹胚时期。表明这些亲本特异DHS是可以随发育遗传的，其附近有76个基因，这些基因可能是新的印迹基因。这些基因中有28个在AG或者PG桑椹胚胚胎里表达，转录组分析发现其中有27个表现出亲本特异表达。这其中有13个可以在正常桑椹胚胚胎中通过单核苷酸多态（SNP）追踪其转录的亲本来源的基因。转录组数据表明这13个基因的转录都表现亲本特异性，并且这种亲本特异性依赖于父母本间差异H3K27me3修饰。通过过表达H3K27me3去甲基化酶Kdm6b去除H3K27me3可以消除这些基因转录的亲本特异性。这些基因中包括所有四个已知的非典型印记基因。从而这些证据表明H3K27me3控制了非典型基因印记的建立与维持并且有更多非典型印记基因存在。
小鼠早期胚胎发育过程中，H3K27me3介导的非典型基因印迹发生的过程。
最后通过追踪更晚发育时期各个谱系里非典型基因印迹的维持状态，研究者发现非典型基因印迹在胚胎着床后的胚胎组织丢失，而在胚外胎盘组织维持（上图）。这与典型基因印迹在胚胎与胚外组织都维持只在原生殖细胞中被擦除很不一样。
总的来说，该研究揭示了一个新的基因印迹调控机理，并且鉴定了多个新的印迹基因。这些发现打开了研究非典型基因印迹相关研究这个新领域的大门，为更进一步理解基因印迹发生的机制及其功能奠定了坚实的理论基础。
据悉，该论文主要由三位共同第一作者Azusa inoue、蒋岚和陆发隆协作完成，Azusa inoue和蒋岚目前是张毅实验室博后，陆发隆博士目前已经回国在中科院遗传发育所建立起了实验室，并入选了第十三批“青年千人计划”。
张毅教授
专家点评：
朱冰（中科院生物物理所研究员，国家“杰青”，HHMI国际青年学者）
Comments：基因的转录是由识别DNA序列的转录因子（TF）和基因所处的表观遗传环境所共同调控的。转录因子对于其靶基因的表达是必要的，但不是充分的。这方面最好的例子就是基因印迹现象（genomic imprinting）。对于多数基因来说，来自于父亲和母亲的两个等位基因具有相仿的转录活性，但在哺乳动物中有数百个基因的表达却具有亲本来源特异性，或者说有些基因只有来自于父亲的那个拷贝才能表达，有些基因则相反。这些基因被称为印迹基因（imprinted gene）。序列完全相同的两个等位基因可以在同一个细胞里、存在着完全相同的转录因子的情况下拥有截然相反的转录活性，这表明转录因子的存在并不能完全决定其靶基因的表达。因此，这一现象成为了一个经典的表观遗传现象。
基因印迹现象的分子机制已经有了大量的研究，许多基因的印迹表达是由不同亲本来源的等位基因调控区的差异性DNA甲基化造成的。然而，也已经观察到有些印迹基因并不受DNA甲基化的调控，它们的调控机制尚不明朗。张毅实验室的这篇文章报道的就是一个新型的印迹基因调控机制，组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）。
基因表达的状态与其染色质开放程度密切相关。去年，张毅实验室发展了一种在少量细胞中测定染色质开放程度的技术，并测定了哺乳动物早期胚胎发育过程中染色质开放程度的动态性，工作发表在Cell杂志。利用这一技术，在本项研究中，他们进一步测定并分析了父源和母源基因组在早期胚胎中的染色质开放程度差异，发现了一些新的印迹表达基因。通过关联性研究，他们发现其中部分印迹基因与DNA甲基化无关，而是和H3K27me3密切相关。通过干预H3K27me3，他们成功消除了这些基因的印迹表达现象，使两个等位基因同时发生活跃转录。
这一工作在两个方面非常出色，首先是工作的新意，发现了基因印迹的新型调控机制；然后是工作的递进性，先通过描述性的测定工作找到父、母源基因组差异表达的新印迹基因，再通过关联性研究发现其与H3K27me3的相关性，最后通过干预证明H3K27me3对这些印迹基因调控的因果性。即新颖又扎实，所以Nature以长文形式发表是很自然的事情。
最后，我还想说这项工作是和张毅实验室在相关领域的长期系统性积累分不开。H3K27me3的甲基化酶是他实验室首先报道的，他们后续在相关领域做出了一系列重要的工作，近年来他们在哺乳动物早期胚胎发育过程中的表观遗传动态和机制方面也有多项重要的工作，现在发现H3K27me3对基因印迹的调控作用应该算是水到渠成吧。
参考文献：
1、Barlow, D. P., & Bartolomei, M. S. (2014). Genomic imprinting in mammals. Cold Spring Harbor perspectives in biology, 6(2), a018382.
2、McGrath, J., & Solter, D. (1984). Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell, 37(1), 179-183.
3、Surani, M. A. H., Barton, S. C., & Norris, M. L. (1984). Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature, 308(5959), 548-550.
4、Barlow, D.P., et al., The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus. Nature, 1991. 349(6304): p.84-7.
5、 DeChiara, T.M., E.J. Robertson, and A. Efstratiadis, Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell, 1991. 64(4): p. 849-59.
6、 Bartolomei, M.S., S. Zemel, and S.M. Tilghman, Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature, 1991. 351(6322): p. 153-5.
7、Wan, L. B., & Bartolomei, M. S. (2008). Regulation of imprinting in clusters: noncoding RNAs versus insulators. Advances in genetics, 61, 207-223.
8、Lee, J. T., & Bartolomei, M. S. (2013). X-inactivation, imprinting, and long noncoding RNAs in health and disease. Cell, 152(6), 1308-1323.
9、Okae, H. et al. Re-investigation and RNA sequencing-based identification of genes with placenta-specific imprinted expression. Hum. Mol. Genet. 21,548–558 (2012).
10、 Okae, H. et al. RNA sequencing-based identification of aberrant imprinting in cloned mice. Hum. Mol. Genet. 23, 992–1001 (2014).
11、Umlauf, D. et al. Imprinting along the Kcnq1 domain on mouse chromosome 7 involves repressive histone methylation and recruitment of Polycomb group complexes. Nat. Genet. 36, 1296–1300 (2004).
12、Lu, F., Liu, Y., Inoue, A., Suzuki, T., Zhao, K., & Zhang, Y. (2016). Establishing chromatin regulatory landscape during mouse preimplantation development. Cell, 165(6), 1375-1388.
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