单碱基编辑（Base Editing）是一种能够在基因组中直接实现碱基替换的技术，无需依赖DNA双链断裂（DSB）和同源重组修复。与CRISPR-Cas9系统相比，该技术具有更高的精确性和更低的脱靶风险，广泛应用于遗传疾病模型构建、功能基因组学研究及潜在基因治疗领域。
1.
Cas9变体蛋白
：通常使用dCas9（完全失去核酸酶活性）或nCas9（保留单链切口酶活性），通过向导RNA（sgRNA）靶向定位至目标DNA区域。
-
胞嘧啶脱氨酶（如rAPOBEC1）
：在CBE（Cytosine Base Editor）系统中催化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），后续DNA复制中U被识别为胸腺嘧啶（T），实现C→T（或G→A）的转换。
-
腺嘌呤脱氨酶（如TadA*变体）
：在ABE（Adenine Base Editor）系统中催化腺嘌呤（A）转化为肌苷（I），复制后I被识别为鸟嘌呤（G），实现A→G（或T→C）的转换。
3.
DNA修复抑制元件
：尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）可阻断尿嘧啶的切除修复，提高编辑效率。
![]()
碱基编辑策略：在由向导 RNA（绿色）指定的位点处具有靶标 C（红色）的 DNA 由 dCas9（蓝色）结合，从而介导局部 DNA 链分离。通过束缚的 APOBEC1 酶（红色）进行的胞苷脱氨将单链靶标 C→U 转化。图片来
源：doi: 10.1038/nature17946。
1. sgRNA引导Cas9蛋白结合至目标DNA区域，形成R-loop结构，暴露单链DNA。
2. 脱氨酶对单链DNA中的特定碱基（C或A）进行化学修饰。
3. DNA复制或修复过程中，修饰后的碱基被固定为永久性改变。
（1）坐标定义：
-
以sgRNA的5'端第一个核苷酸为第1位，向3'端依次编号
-
PAM序列（NGG）位于sgRNA的3'端下游，不计入sgRNA的20 bp序列
（2）不同编辑器的活性窗口：
（3）实验验证方法：
-
合成包含目标位点的DNA片段（如gBlock），通过体外编辑实验测定窗口效率
-
使用CRISPOR或Benchling输入目标基因序列（如NCBI Gene ID），设置以下参数：
CBE系统：sgRNA第4-8位（以PAM远端为第1位）
ABE系统：sgRNA第4-7位
-
脱靶分析：勾选“全基因组脱靶扫描”，排除与其它基因同源性>80%的候选sgRNA
假设目标位点为人类HBB基因c.20A>T突变（镰刀型细胞贫血）：
-
靶序列：5'-GACGTGCGACTGAGGAGAAG
[T]
CTGC-3'（方括号内为突变位点）
-
设计sgRNA：5'-GAC
TGAGG
AGAAGTCTGCGG-3'（下划线为编辑窗口，PAM为GG）
-
上游引物（含Overhang）：
5'-CACCG**
N20
**-3'（N20为sgRNA靶序列，不含PAM）
-
下游引物：
5'-AAAAC**
N20rev
**-3'（N20rev为sgRNA靶序列反向互补）
3. 程序设置：
95℃ 5min → 每分钟降温1℃至25℃ → 4℃保存
1. 载体酶切：
使用BsmBI限制性内切酶（Thermo Fisher, #ER0451）切割pU6-sgRNA载体：
-
挑取单菌落接种于LB培养基（含Amp抗性），37℃摇菌12h
-
-
Sanger测序验证（引物：U6-F: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'）
