简介
荧光显微镜中的分辨率定义为样品上两点之间仍可区分的最短距离。这主要由两个因素决定；显微镜分辨率，即显微镜可以分辨的最小物体，以及相机分辨率，即相机检测显微镜可以分辨的物体的能力。
显微镜的最大分辨率是物镜数值孔径和样品发射波长的函数，而相机分辨率完全由像素大小决定。
然而，荧光显微镜的分辨率最终受到光的衍射极限的限制，例如，当使用绿光 (510 nm) 时，该极限约为 220 nm。这为可以解决的问题设定了下限。因此，标准荧光显微镜中的常见做法是使用能够达到此下限的显微镜设置来检测最小的可分辨物体。使用传统显微镜无法尝试比这更低的分辨率，只有使用超分辨率技术才能打破光的衍射极限。
显微镜分辨率
光以波的形式传播，因此当它用透镜聚焦到一个小点时，无论物镜有多好，焦点的尺寸都会比实际的荧光团大。
图 1：在物镜孔径边缘发生衍射的荧光发射器的衍射图案。最终的衍射极限点在 x 和 y 方向可能是 200-300 nm，在 z 方向可能是 500-800 nm。
这是因为荧光发射的波前（wavefront）在物镜孔径的边缘发生衍射。这有效地将波前传播出去，将荧光发射加宽为中心点大于原始荧光团的衍射图案（图 1）。
衍射极限光斑的大小大约是发射光波长大小的一半，但由 Ernst Abbe 在 1873 年确定的完整方程为：
𝑑 = 𝜆 / 2NA
其中 d 是衍射极限光斑的大小，λ 是所用光的波长，2NA 是物镜数值孔径的 2 倍。
对于 GFP 发射波长为 ~510 nm 和高数值孔径(NA 1.4)物镜的情况，显微镜解析的荧光团的大小为 182 nm。这比实际的荧光团大得多，实际荧光团可能只有 2 nm。
艾里斑
衍射极限光斑呈艾里斑的形状（图 2），以 George Biddell Airy 的名字命名。它由一个明亮的中心点和一系列围绕它的衍射环组成。中心光斑的大小由发射光的波长和物镜的数值孔径决定。
图 2 突出显示了增加物镜的数值孔径如何减小艾里斑的尺寸，从而增加可分辨细节的数量。
图 2：由低、高和高数值孔径物镜产生的艾里斑。
瑞利判断
解析相邻荧光团的问题在于，随着艾里斑靠得更近，它们彼此融合并变得无法解析（图 3）。因此，在 1896 年，瑞利勋爵改进了阿贝方程，以考虑到两个荧光团需要相距多远才能区分它们：
𝑑 = 1.22𝜆 / 2NA
通过这种改进，使用高数值孔径 (NA 1.4) 物镜区分两个 GFP 荧光团所需的距离将为 222 nm。
图 3：两个艾里斑合并，直到两个中心点无法再区分
物镜分辨率限制
表 1 中的信息突出显示了使用 GFP (510 nm) 发射的各种不同放大倍数物镜和数值孔径可能存在的分辨率限制。
需要注意的是，物镜放大倍数对分辨率没有影响，数值孔径是唯一重要的值。100x、1.40 NA 物镜与 60x、1.40 NA 物镜具有相同的分辨能力。同样，100x、1.30 NA 物镜与 40x、1.30 NA 物镜具有相同的分辨能力。
这就引出了一个明显的问题，如果 40 倍放大率达到相同的分辨率，为什么要使用 100 倍或 60 倍放大率？当使用更高放大倍率的物镜时，视野会无缘无故地受到限制。
通过使用较低放大倍率的物镜，从 100x、1.30 NA 物镜变为 40x、1.30 NA 物镜，视野增加了 450%。这表示样品面积增加了 450%，而分辨率没有损失。
同样，通过将 60x、1.30 NA 物镜更改为 40x、1.30 NA 物镜，样品面积增加了 200%。
那么为什么要使用更高放大倍率的物镜呢？这就是相机分辨率的用武之地。放大倍数在科学相机的分辨率中起着重要作用。
表 1：使用具有 GFP (510 nm) 发射的不同物镜的显微镜分辨率。所有数字都假设在一个完美对中和优化的光学系统下。
相机分辨率
相机分辨率定义为相机传感器对图像进行采样的能力，科学相机的分辨率完全取决于像素的大小和放大的程度。图 4 突出显示了科学相机像素大小是如何通过物镜放大倍率改变的。
图 4：科学相机的分辨率取决于像素大小。6.5 μm 像素尺寸缩小 10 倍物镜导致有效像素尺寸为 0.65 μm，40x 物镜导致有效像素尺寸为 0.1625 μm，60x 物镜导致有效像素尺寸为 0.108 μm
将相机分辨率与显微镜分辨率相匹配的最明显方法似乎是将表 1 中给出的衍射极限分辨率与单个像素的大小相匹配。然而，这种情况并非如此。目标不仅仅是匹配显微镜分辨率，而是区分相邻物体。
奈奎斯特采样
如图 5 所示，如果显微镜分辨率与单个像素的大小相匹配，则两个相邻的物体可能会成像到相邻的像素上。在这种情况下，将无法在结果图像中将它们识别为两个独立的对象。
分离相邻特征需要存在至少一个具有不同强度值的中间像素。因此，可以实现的最佳空间分辨率需要将显微镜的衍射极限分辨率与传感器上的两个像素相匹配。这称为奈奎斯特采样，可以使用以下公式计算：
相机分辨率 =（像素大小/物镜倍率）x 2.3
Camera Resolution = (Pixel Size / Objective Power) x 2.3
图 5：奈奎斯特采样。在第一个示例中，相机传感器像素小于对象但无法完全解析细节，导致图像为假。使用 Nyquist 采样，传感器像素大小减半，因此可以以两倍的速率进行采样，并解析样本中的细节。
将相机分辨率与显微镜分辨率相匹配
表 2 和表 3 说明了在不同放大倍率下实现奈奎斯特采样所需的像素大小。这些表格提供了之前提出的问题的答案：如果 40 倍放大倍数达到相同分辨率，为什么要使用 100 倍或 60 倍放大倍数？
如前所述，要使用 GFP (510 nm) 实现 Nyquist 采样并匹配显微镜分辨率，相机分辨率应达到 0.22 μm。表 2 显示，对于 40x 物镜，6.5 μm 像素太大，因为由此产生的相机分辨率为 0.37 μm。6.5 μm 像素被认为足以进行 60 倍的放大，但是，因为由此产生的相机分辨率达到 0.25 μm。
因此需要较小的像素来实现 40 倍的奈奎斯特采样。表 3 显示 4.25 μm 的较小像素尺寸达到 0.24 μm 的相机分辨率，放大倍数为 40 倍，满足 Nyquist 要求。
表 2：物镜放大率对 6.5 μm 像素可能的相机分辨率的影响以及是否匹配 Nyquist 采样
表 3：物镜放大率对 4.25 μm 像素可能的相机分辨率的影响以及是否实现奈奎斯特采样
本节中提供的数据表明，可以使用的最低放大倍数受相机像素大小的限制，需要足够小以匹配显微镜分辨率。
较小像素的相机允许使用较低的放大倍数，这具有在视场中看到更多样本的优势。
总结
有两种类型的分辨率；显微镜分辨率和相机分辨率。显微镜分辨率由物镜的数值孔径和发射波长决定，而相机分辨率由像素大小决定。
使用较低 (40x) 放大倍率的物镜可以达到衍射极限分辨率，但像素大小会受到限制。为了解决这个问题，已经开发出具有较小像素的相机，以允许研究人员转向较低放大倍率的物镜。这具有在不牺牲分辨率的情况下增加视野的优点。只需从 60 倍切换到 40 倍，研究人员就有望将通量提高 200%。
来源南京衡桥仪器有限公司，
翻译转载自 Teledyne Photometrics
本文仅做学术分享，如有侵权，请联系删文。
