资料来源:《2023合成生物驱动美丽健康消费品产业报告》
明星底盘细胞—毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母,是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样,在无性生长期主要以单倍体形式存在,当环境营养限制时,常诱导2个生理类型不同的结合型单倍体细胞交配,融合成双倍体。
1.提取工艺
取废毕赤酵母泥→按其干重配成一定浓度的悬浮液50 mL(含一定浓度的NaOH)→在一定温度下保温提取一定时间→离心→弃去残渣→上清液浓缩,加四倍量的乙醇→低温过夜→离心取沉淀→测定多糖含量。
2.开发价值
(1)毕赤酵母——酵母表达的高分选手
作为真核生物,毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点:
如糖基化、信号肽追加等后转译能力
,
且实验操作简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价,且表达水平更高。同为酵母,毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点,且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
(2)利用毕赤酵母可筛选到高表达菌株
通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定,不易丢失;且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中,能够筛选到高表达菌株。
(3)有利于外源基因的调控表达的基因毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达。
(4)分泌性外源蛋白易于分离由于酵母本身仅分泌少量蛋白,因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数,这大大降低了蛋白质分纯的难度。
3.应用前景
利用毕赤酵母系统可以生产医用高效蛋白质,如用毕赤酵母生产的重组蛋白有牛胰蛋白酶原、人2A型蛋白磷酸酯酶(PP2A)亚基、乙型肝炎病毒前S1蛋白、戊型肝炎病毒开读框架2片断、人白介素-2、肿瘤坏死因子。另外肿瘤细胞的一个关键的蛋白酶MT1-MMP,在删去C末端跨膜区后,转化酵母并获得表达,这对于癌症的治疗有重要的意义。蓓晶医用重组III型人源化胶原蛋白就是利用重组基因工程法通过毕赤酵母菌表达系统研制而成。
底盘细胞优化
由于细胞的复杂性,人工置入的生物元件、线路或系统往往会受到细胞内原有代谢与调控途径的影响。因此,为了实现合成生物学的目标,需要在多个方面进行研究和优化。
模式微生物方面,George Church团队在大肠杆菌中开发的多重自动化基因组工程进行大规模的细胞编程和进化等。2023年赵惠民团队开发了以酿酒酵母为细胞底盘的RNAi辅助的自动化基因组进化方法RAGE。
在非模式底盘方面,中国科学院天津工业生物技术研究所王猛团队依托高通量基因编辑与筛选自动化平台,在谷氨酸棒状杆菌中开发了多元自动化基因组编辑方法MACBETH,实现了质粒构建、基因组编辑、克隆筛选和表型验证的全流程自动化操作,可实现每月数千突变株的编辑。此外,该团队还开发了基于液滴微流控的链霉菌高通量培养和筛选技术,检测分选速度达到每小时1万菌株,人工混库的单轮分选富集率超过了330倍。
构建底盘细胞挑战
在微生物细胞工厂的构建过程中,需要解决诸多挑战。例如,超过99%的已知微生物难以在实验室培养,且易出现生长速度缓慢、编码基因不表达等情况;其二,天然产物的生物合成水平较低,野生型菌株的次级代谢产物合成水平通常在mg/L水平或更低,造成了活性天然产物分离鉴定和活性测定的困难。