夏老师在PubMed上冲浪的时候，发现现在很多高分文章的聚焦点，都从单纯的基因间的相互关系，转而向代谢产物与基因间的关联性，从而引发产生表型了。而且这样的文章一般都做得相当不错，今天就带你们看看这篇中山大学附属中山纪念医院发表在48.8分的Cell子刊，这篇文章讲的是肿瘤的代谢产物对于CD8+ T细胞和NK细胞的免疫抑制，有点儿意思：
他们首先分析的是ICB（免疫检查点阻断治疗）的HER2乳腺癌患者的样本，这里他们主要针对的是曲妥珠单抗和抗PD-L1抗体耐药的乳腺癌样本。他们发现在这些患者的转录组中，NAT8L的基因表达明显增多，同时他们也分析了代谢组，结果发现NAT8L蛋白参与代谢的产物NAA也明显增多。而通过单细胞测序发现（下图这样的UMAP图大家应该能看懂吧，在《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》里介绍过，也就是通过不同基因的表达来分析细胞簇的），NAT8L的表达基本上都是在肿瘤细胞中的：
他们首先对NAT8L的功能提出了一个假设，假设NAT8L是通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等表型引发的耐药。但敲除了NAT8L后，并没有对肿瘤增殖或者凋亡产生影响（这个其实也是试图通过柯霍氏法则以及反向遗传学，对NAT8L进行表型的相关性研究，不清楚的话，可以看看《科研的推理和逻辑——从实验台到咖啡桌》、《轻松的文献导读》）。接着他们发现，在免疫缺陷型小鼠中，敲除了NAT8L并不能对肿瘤产生抑制，而含有免疫细胞的小鼠中敲除了NAT8L则可以抑制肿瘤细胞增殖。这也就说明NAT8L的表达，以及其代谢产生的NAA很可能与抑制免疫细胞有关：
于是他们迭代了假设，假设表达NAT8L的肿瘤细胞可以抑制CD8+ T细胞或者NK细胞，通过验证发现，的确高表达NAT8L的乳腺癌细胞系，是可以抑制CD8+ T细胞或者NK细胞对肿瘤细胞的损伤，而低表达NAT8L的则并没有抑制效果：
同时他们发现NAA的表达与NAT8L的表达是成正比的，而NAT8L还有诸如NAAG之类的代谢产物，那么具体是那种代谢产物影响了CD8+ T细胞或者NK细胞对肿瘤细胞的损伤呢？于是他们在敲除了NAT8L的情况下，分别给细胞补充了NAA和NAAG。结果发现只有NAA会起到恢复CD8+ T细胞或者NK细胞对肿瘤细胞的损伤作用的抑制（这其实也是柯霍氏法则的验证方法，通过移入或者移除某个因素，造成表型差异，可以看看《科研的推理和逻辑——从实验台到咖啡桌》、《轻松的文献导读》），这也就说明了NAT8L很可能是通过NAA影响：
接着这一步其实是间接来说明NAT8L对细胞的保护作用的，由于NAT8L主要是在大脑中表达，而NAA是神经元损伤的标志物。他们发现在NK细胞导致的神经元炎症产生后，NAT8L缺陷的小鼠中补充NAA可以保护减轻神经元的损伤：
那么既然证明了NAT8L通过代谢产生NAA，引发了对细胞的保护，那么具体是什么样的机制呢？他们分析了NAA处理后，NK细胞的表面标志物。结果发现NK细胞表面的CD107a的表达明显受到了NAA的抑制，而CD107a是NK细胞上裂解颗粒内容物递送的标志物。于是他们假设迭代成了NAA可能会影响NK细胞与肿瘤细胞之间的接触连接，通过免疫荧光验证发现，NAA的确能抑制NK细胞的IS（免疫突触）的形成：
那么问题又来了，NAA是通过什么来影响NK细胞形成IS的呢？那么首先要解决的就是NAA细胞是否能和蛋白结合，是能和什么样的蛋白结合，通过亲和分析，他们找到了一批能和NAA结合的蛋白，其中就又LMNA，LMNA是与IS形成有关的蛋白。为了解释LMNA对于NK细胞的功能的关键性，他们敲除了LMNA后发现，NK细胞对于肿瘤的抑制作用降低了：
那么NAA是怎么样影响LMNA的呢？他们通过对于NAA与LMNA结合后的质谱分析，发现了NAA结合LMNA后对LMNA产生了的蛋白修饰，他们发现了三个LMNA的相关的乙酰化位点。这里他们对着三个位点都进行了突变，结果发现只有K542这个位点突变后（他们采用了两种突变形式，乙酰化抑制和模拟乙酰化，这样对单个位点的突变，可以更好且更严谨地说明NAA对于LMNA的乙酰化功能造成了最终的表型，从而避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件的话，可以看看《科研的推理和逻辑——从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），会影响NK细胞对于肿瘤的抑制作用：
那么问题还是没有解决，NAA是通过什么途径对LMNA的K542位点进行乙酰化的呢？首先他们想到了NAA的代谢产物有乙酸盐（也就是乙酰化底物），于是他们假设乙酸盐可能是导致LMNA乙酰化的关键，但验证结果发现乙酸盐对于LMNA的乙酰化并没有影响。由于之前NAA结合的蛋白中，有一个是PCAF（p300/CBP相关因子，p300和CBP大家应该都熟悉了，这两个蛋白在很多信号通路中，比如FOXO信号通路中，都起到了乙酰化激活的功能，不熟悉的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们就在这个基础上，又进行了假设的迭代，假设NAA是由于同时能结合PCAF和LMNA，所以促进了PCAF与LMNA的结合，导致了LMNA的乙酰化。验证结果，也符合了他们的预期：
那么LMNA的K542乙酰化，对于IS的形成又有什么贡献呢？由于LMNA可以通过核骨架和LINC（细胞骨架）复合物的连接子，将细胞核连接到质膜，从而增强IS形成过程中肌动蛋白的聚合。LINC复合体是由外核膜nesprins和内核膜SUN蛋白(SUN1和SUN2)组成的。于是他们就假设LMNA的乙酰化可能会影响其与LINC复合体的结合，结果发现LMNA的乙酰化模拟突变，会损害其与SUN2的结合，从而抑制了IS形成：
最后，就形成了这样的示意图。肿瘤细胞中高表达的NAT8L会产生大量的NAA，NAA结合并促进免疫细胞如NK细胞或CD8+ T细胞中的PCAF与LMNA的结合，促进LMNA的K542位点乙酰化，乙酰化后的LMNA与SUN2的结合被损害，导致NK细胞的IS无法形成，也就无法起到杀死肿瘤细胞的作用，这也就是ICB耐药产生的关键之一：
这篇文章整体上完成度极高，通过不断地假设及假设迭代，挖掘出了NAT8L及NAA的完整通路。每个验证的环节都相对来说十分严谨。可以通过LMNA的乙酰化位点的赖氨酸突变，来验证该位点的乙酰化的重要性，光是这一点就已经十分值得学习了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话一定要看看原文，祝你们心明眼亮。
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