亚硝胺杂质是一类具有亚硝基与胺结合（R1N (-R2)-N=O）的化学结构的化合物，具有高潜在致突变致癌性。自华海缬沙坦事件以来，多种药品中相继检出小分子亚硝胺类杂质或与原料药相关的亚硝胺类杂质（NDSRIs），使得监管机构、制药企业对该类杂质一直高度关注，相关的指南文件也一直在持续更新，9月，FDA也更新了人用药物中亚硝胺杂质控制指南。这份指南，是FDA结合其他主要监管机构包括EMA等在近几年来对药品中亚硝胺杂质的控制要求基础上进行的更新，是当前亚硝胺杂质研究相对最为完善的指南。
下面我们将结合指南，从指南的适用范围、亚硝胺杂质来源、亚硝胺杂质的控制措施等方面进行介绍。
- 含有化学合成的 APIs 或片段的药物产品（包括含有合成片段的生物制品）；
- 由于其结构而存在风险的半合成和发酵产品，类似于化学合成的APIs。
一类是小分子亚硝胺杂质（与活性药物成分API没有结构相似性且在许多不同药品中可被发现的亚硝胺杂质）。
如NDMA、NDEA、NMPA、NDIPA、NIPEA、NDBA、NMBA等，这类亚硝胺杂质主要通过胺（仲胺、叔胺或季铵盐）与亚硝酸（酸性条件下的亚硝酸盐）之间的亚硝化反应形成（图一），也可以由1,1-二取代肼氧化形成亚硝胺，如化合物1-环戊基-4-亚硝基哌嗪和1-甲基-4-亚硝基哌嗪是通过肼氧化过程形成的。另一类是与API或API片段具有结构相似性且通常对每个API而言独一无二的的亚硝胺杂质（NDSRIs）。
当含有仲胺、叔胺或季铵盐的API（或API相关片段）暴露于亚硝化化合物（如辅料中的亚硝酸盐杂质）时，会通过亚硝化作用形成NDSRIs，图二展示了在酸性条件下，结构中含有仲胺官能团的API与亚硝酸盐的代表性反应。对于NDSRI可通过FDA网址CDER Nitrosamine Impurity Acceptable Intake Limits | FDA进行查询，可获取部分药物中NDSRI可接受摄入量、推荐分析方法等信息，且定期更新。
在存在仲胺、叔胺或季铵以及亚硝酸盐的情况下，在酸性反应条件下可能会形成亚硝胺。如果在前体胺存在的情况下使用亚硝酸来淬灭残留的叠氮化物（一种常用于四唑环形成或在分子中引入叠氮官能团的试剂），则形成亚硝胺的风险更大。注意，在一个合成步骤中用作试剂的亚硝酸盐可能会残留至后续步骤中，尽管进行了纯化，仍可能与胺反应生成亚硝胺杂质。因此，只要存在亚硝酸盐，就不能排除其残留到后续步骤中的可能性。一般来说，在有仲胺、叔胺或季铵存在的情况下使用亚硝酸盐的工艺有产生亚硝胺杂质的风险。
API或API降解物、中间体或合成API原材料（包括起始物料、试剂、溶剂等）可能含有仲胺或叔胺官能团。叔胺和季铵也可能有意地作为试剂或催化剂被添加。所有这些类型的胺都可以与亚硝酸或其他亚硝化剂反应形成亚硝胺。
酰胺溶剂在某些反应条件下容易降解形成仲胺，如在长时间的高反应温度下，N,N-二甲基甲酰胺可以降解为二甲胺，二甲胺可以与亚硝酸反应形成N-亚硝基二甲胺（NDMA）（图三）。N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺和 N,N-二乙基乙酰胺也有类似的降解途径，产生可形成亚硝胺杂质的仲胺。仲胺也可作为杂质存在于酰胺溶剂中，如二甲胺可能作为杂质存在于 N,N-二甲基甲酰胺中。
图三 N,N-二甲基甲酰胺形成N-亚硝基二甲胺机理
在API合成中用作试剂的叔胺和季铵可能含有其他胺杂质。叔胺，如三乙胺，已被证明含有低水平的其他仲胺（如二丙胺和异丙基乙胺）。仲胺和叔胺可能作为杂质或由季铵脱烷基形成的降解物存在。例如，常见的相转移催化剂四丁基溴化铵中可能含有三丁胺和二丁胺杂质。
当供应商来源的原材料含有亚硝胺或亚硝胺前体时，可能会引入亚硝胺杂质。美国食品药品监督管理局已经观察到供应商来源材料中亚硝胺杂质的以下根本原因：在新鲜溶剂（邻二甲苯、甲苯和二氯甲烷）中发现了亚硝胺，这是在溶剂运输过程中使用的储存容器之间转移时杂质被携带过来导致的。
亚硝酸钠是某些起始物料（如叠氮化钠）中的已知杂质，并且可能在酸性条件下与胺反应形成亚硝胺。含硝酸盐的原材料，如硝酸钾，可能含有亚硝酸盐杂质。
仲胺或叔胺在一些原材料中被报告为杂质，并且在新鲜溶剂如甲苯中也有发现。
API起始物料和API中间体如果与可能产生亚硝胺杂质的其他工艺共线，则可能面临交叉污染的风险。
回收的材料如溶剂、试剂和催化剂可能由于存在残留胺类（如三甲胺或二异丙基乙胺）而带来亚硝胺杂质的风险。如果回收过程涉及淬灭步骤（如使用亚硝酸分解残留的叠氮化物），那么在溶剂回收过程中可能会形成亚硝胺。
★ 可形成亚硝胺杂质的淬灭工艺以及缺乏过程优化和控制
亚硝酸盐是常见的亚硝化杂质，在许多辅料中以百万分之一（ppm）的水平被报道过。在一系列常用辅料中都发现了亚硝酸盐杂质，这可能导致在药品生产过程和保质期储存期间药品中形成亚硝胺杂质。
饮用水中可能存在亚硝酸盐和亚硝胺杂质。
此外，当仲胺、叔胺和季铵等亚硝胺前体（包括 API 片段）作为杂质存在于药物中时，这些前体可以与辅料中的亚硝酸盐或生产过程中其他来源的亚硝酸盐反应，在药品中形成小分子亚硝胺或与药物相关的亚硝胺杂质（NDSRIs）。
一些容器密闭系统，包括二级包装组件和生产设备可能是亚硝酸盐或亚硝胺杂质的来源。这些杂质可能在生产或储存过程中渗入药品中，导致小分子亚硝胺杂质或 NDSRIs。
药品中存在与药物相关的亚硝胺杂质
（NDSRIs）的根本原因
与药物相关的亚硝胺杂质（NDSRIs）可以在药品制造过程中或在成品药的保质期储存期间产生。药品中存在 NDSRIs 的已知根本原因是：
（1）亚硝化杂质，如辅料中残留的亚硝酸盐或药品中存在的其他亚硝酸盐杂质，在特定条件下会导致活性成分被亚硝化从而产生 NDSRIs；（2）从活性药物成分（APIs）中携带过来的 NDSRIs。一般来说，高水平的NDSRIs 更多地与药品而非APIs相关，因为NDSRI的形成最常是由API或API片段与药品中存在的亚硝酸盐杂质之间的反应引起的。
因此，在储存期间，NDSRI 的水平可能会增加。如果含有具有仲胺、叔胺或季铵基团的 APIs 的药品暴露于亚硝化剂中，则被认为有形成 NDSRI 的风险。
✔ 确定特定亚硝胺的可接受摄入量限值的方法可以基于数据库和文献搜索以获取可用的致癌性和细菌致突变性数据，或者使用特定化合物进行体内和/或体外测试。AI值可以采用公开文献中报道的研究较为完善的啮齿动物致癌效价数据如TD50值进行外推计算。✔ 杂质没有相关的TD50数据或TD50数据研究不够完善，如果有科学依据，也可以使用来自具有可靠致癌性数据的结构相似替代物的交叉参照分析。如NDBA和N⁃亚硝基⁃N⁃甲基⁃4⁃氨基丁酸（NMBA）的AI值均采用此种方式。✔ FDA 建议，在特定亚硝胺化合物的可靠致癌性数据和其他安全信息（包括细菌致突变性数据）不可用时，可使用预测致癌效力分类方法确定可接受摄入量限值。FDA 在亚硝胺指南网页上公布了某些 NDSRIs 的推荐可接受摄入量限值。若没有公布的可能NDSRIs推荐AI限值，生产商和申请人可以使用致癌效力分类方法确定AI，并与监管机构联系来确认拟定的AI限度的可行性。✔ 如果无法使用本节中描述的方法确定可接受摄入量限值，FDA 建议将 26.5 ng/day 用作可接受摄入量限值。✔ FDA 推荐的可接受摄入量限值对应于单个亚硝胺杂质，并且仅在药品中含有单个亚硝胺时适用。FDA 建议，当识别出一种以上亚硝胺时，亚硝胺的总限值不应超过药品中最具效力的亚硝胺的推荐可接受摄入量限值。FDA 也认识到，如果单个亚硝胺的推荐可接受摄入量限值差异很大，那么基于最具效力的单个亚硝胺限值来确定总亚硝胺限值可能不切实际，此时可能需要采用替代方法。✔ 当药品中存在多种亚硝胺杂质（例如小分子亚硝胺和 NDSRIs）时，可以使用一种替代的灵活可接受摄入量限值方法来建立规格。制造商或申请人可以确保亚硝胺杂质的总量水平导致的接触水平不超过 ICH M7 (R2) 中概述的可接受的 1:100,000 癌症风险。
一般来说，需要具有适当定量限（LOQs）的灵敏分析方法来测试药品是否能够满足针对亚硝胺杂质推荐的可接受摄入量限值。
三步缓解策略，包括风险评估、确认性测试和
向FDA报告变更
① 对其已获批准或已上市的产品以及待审批申请的产品进行风险评估；② 如果识别出风险，则进行确认性测试，由于亚硝胺的物理化学性质（低分子量、一定的挥发性和高毒性），亚硝胺的分析测试方法需要具有特异性、出色的色谱分离能力和高度灵敏的检测能力；③ 向FDA报告为防止或减少 API 和药品中亚硝胺杂质而实施的变更。
3.1 减少活性药物成分（APIs）中的亚硝胺杂质
API 制造商应在合成路线（ROS）开发期间优化工艺设计，以最大程度地减少或防止亚硝胺杂质的形成。
尽可能避免可能产生亚硝胺的反应条件；如果无法避免，则通过适当且稳健的清除研究证明该工艺得到充分控制，并且能够始终将亚硝胺杂质降低至推荐的可接受摄入量限值内。
如果合成路线条件可能形成亚硝胺，则在可能的情况下使用仲胺、叔胺或季铵以外的碱。
如果可能的话，避免使用酰胺溶剂（例如 N,N - 二甲基甲酰胺、N,N - 二甲基乙酰胺和 N - 甲基吡咯烷酮）
在叠氮化物分解过程中用其他淬灭剂替代亚硝酸盐。
优化并始终控制反应顺序、工艺和反应条件（如 pH 值、温度和反应时间）。
设计一种制造工艺，以便在后续加工步骤中促进亚硝胺杂质的清除
活性药物成分（API）制造商应将淬灭步骤（当存在亚硝胺形成风险时，例如使用亚硝酸分解残留叠氮化物）从主反应混合物中移除，以降低亚硝胺形成的风险。API 或通过使用叠氮化物盐进行反应形成的中间体可以从有机相中的母液中分离出来。然后，从有机相中分离出的含水废相应用亚硝酸进行淬灭，且不能与 API、其中间体或拟回收的溶剂接触。
API 制造商应审核其供应链并监测任何有风险的 API 原材料和中间体。
为了避免在制造过程中使用回收的材料（如溶剂、试剂和催化剂）时发生交叉污染，API 制造商应仅在回收材料的同一工艺步骤中或更早步骤（如果有充分的纯化）中使用回收材料。
活性药物成分（API）制造商应留意分析原料药生产中使用的工艺用水中亚硝酸盐和亚硝胺水平。
如果 API 制造商对 API 批次进行再加工或返工以控制亚硝胺杂质水平，质量部门应监督此类批次的任何再加工或返工。
鉴于目前对亚硝胺杂质及其在药物中存在不确定性，对于检测到杂质含量高于推荐 AI 限值10% 的有风险的 API，制造商应在放行时对每批进行检测，并在复验日期对稳定性样品进行亚硝胺杂质检测。
任何发现亚硝胺杂质含量高于推荐 AI 限值的 API 批次，API 制造商都不应放行用于销售。
a．建立 API 供应商的可靠性：
药品制造商和申请人在设计其控制策略时，应评估在使用有风险的 API 的制造过程中是否可能存在亚硝酸盐。制造商和申请人还应确定亚硝胺前体是否作为原料药中的杂质存在，因为它们可能在药品制造过程中形成亚硝胺杂质。制造商和申请人还应评估在药品的保质期内成品药中是否会形成亚硝胺。如果亚硝胺是通过可以避免的外源引入到药品中，制造商和申请人应消除亚硝胺杂质的来源。
b．在药品中建立规格：
此外，鉴于目前对亚硝胺杂质及其在药物中的存在不确定性，即使初始测试结果低于推荐可接受摄入量限值的 10%，也建议对监管批次和验证批次进行测试，并且当在制造过程、辅料、API 或其他关键要素中引入可能在产品生命周期内导致亚硝胺形成的变更时进行测试。
减少或防止药品中与药物相关的亚硝胺杂质
（NDSRI）形成的建议
考虑到不同辅料供应商和辅料批次中潜在的亚硝酸盐杂质，对辅料进行筛选以降低药品中 NDSRI 形成的风险。或者，使用亚硝酸盐含量较低的替代辅料重新配制药品。
在药品设计中加入抗氧化剂（如抗坏血酸（维生素 C）、抗坏血酸盐（如抗坏血酸钠）、α- 生育酚或没食子酸丙酯），这可能会抑制药品中 NDSRI 的形成。
在药品配方中修改微环境至中性或碱性pH。NDSRI 的形成通常发生在酸性条件下；在中性或碱性环境中，这些反应的动力学显著降低。因此，在配方设计中加入如碳酸钠等辅料来修改微环境至中性或碱性 pH 可以抑制 NDSRI 的形成。
参考资料：
FDA：Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry，2024.09
安莱博(江苏)医药科技有限公司（以下简称“安莱博”）成立于2019年，是一家综合性的药物研发技术服务CRO企业，专注于药物和药包材分析技术，以药物杂质制备及杂质分析、药包材分析及其注册登记一体化研究、小分子药物工艺开发及CMC研究、微生物研究及测试等领域为核心业务板块。安莱博致力于成为全球药物研发领域最值得信赖的合作伙伴，为全球药物研发客户提供可靠、快捷的一站式研发服务解决方案，助力医药产业健康发展！
药学质量研究--药物杂质研究（基毒杂质、元素杂质、离子杂质、生物药/生物催化杂质）、微生物研究
药包材备案登记一体化研究--相容性/密封性研究、药包材登记、药包材生物学评价、药用功能性测试平台
仿制药/创新药CMC研究服务--原辅料药质量研究、DMF资料撰写、参比制剂反向分析、API特性研究、制剂处方工艺开发、稳定性研究、仿制药申报资料撰写
产品链服务平台--分子砌块定制合成、仿制药杂质系列对照品合成、试剂关键医药中间体定制合成
