新生肽链经核糖体翻译合成之后，通常会经历一系列折叠与翻译后修饰加工过程，最终产生成熟的蛋白质分子。蛋白质的翻译后修饰主要包括对肽链上多种残基侧链的化学修饰，例如羟化、磷酸化、糖基化、脂酰化等。这些修饰通过改变蛋白表面的亲疏水性、电荷与局部结构来调控其稳定性、亚细胞定位、大分子互作以及降解等重要生物学功能与蛋白质稳态特征。糖基化是主要在内质网中进行的受控酶促过程，天然有序的糖基化是受修饰蛋白正确折叠与定位的重要前提，这一过程的紊乱将导致蛋白质的稳定性受损与定位错误，最终引起蛋白质稳态失衡。糖基化主要包括发生在天冬酰胺残基侧链氨基基团上的N-连接糖基修饰与丝氨酸/苏氨酸侧链羟基基团上的O连接糖基修饰。除上述两种经典糖基化修饰以外，在特定蛋白质中，还存在发生在赖氨酸残基上的特殊糖基化修饰，即羟化-糖基化修饰
【1】
。尽管赖氨酸侧链上的主要活性基团为ε-氨基，但其在双加氧酶的催化下首先发生羟化，随后在半乳糖苷转移酶的催化下进行O-连接的半乳糖基化，最后在葡萄糖苷转移酶的催化下生成O-连接半乳糖基葡萄糖基化修饰（●-●-O-Lys）
【2, 3】
。尽管与经典的N/O连接糖基化相比，受赖氨酸糖基化加工的蛋白质较少
（如胶原蛋白、补体系统蛋白c1q、脂联素等）
，但是一系列遗传与生化研究表明，赖氨酸的羟化-糖基化对于受修饰蛋白的结构稳定与功能发挥至关重要，其过程受损可导致严重的生物学后果与健康问题。
赖氨酸的O连接糖基化修饰至少涉及三个生化反应：
①
赖氨酸的羟化反应；
②
羟赖氨酸的半乳糖基化反应；以及
③
半乳糖苷羟基赖氨酸的葡萄糖基化反应。目前已知有两个酶家族负责这三个反应：多功能前胶原赖氨酸羟化与葡糖基转移酶
（PLOD）
家族负责反应
①
与
③
；胶原β(1-O)半乳糖基转移酶家族
（ColGalT）
负责反应
②
。PLOD家族目前已经发现三个成员基因，即PLOD1-3，分别编码多功能前胶原赖氨酸羟化与葡糖基转移酶LH1-3蛋白，其中LH3被发现是催化胶原螺旋结构域中赖氨酸羟化与葡糖基化的主力酶。ColGalT家族目前由两个成员组成，分别为ColGalT1与ColGalT2，其中ColGalT1是催化多种蛋白的羟赖氨酸半乳糖基化的酶，而ColGalT2的发现历史较短，其催化的底物尚不十分明确。LH3与ColGalT1多种重要分泌蛋白赖氨酸修饰的关键酶，尤其是胶原的成熟前加工。这两种酶功能的缺失均可导致胶原结构的异常并引起相关疾病，例如PLOD3基因突变引起的BCARD综合征
【4】
，具体表现为骨骼脆弱、颅颌面发育异常、耳聋和发育迟缓等。此外，ColGalT1的基因突变可导致脑小血管病，主要影响脑内小血管，可能导致中风、认知障碍等症状
【5】
。由于赖氨酸的O-连接糖基化是涉及三个生化反应有序发生的催化链条，其中LH3与ColGalT1催化的反应交替进行，因此从整体上掌握整个加工修饰链条的催化机制与联动方式，对于理解这一重要非经典糖基化修饰的分子机制至关重要。
2025年3月11日，上海交通大学医学院附属第九人民医院精准医学研究院的
曹禹
团队联合骨科
秦安
团队在
Nature Communications
上发表题为
The structural basis for the human procollagen lysine hydroxylation and dual-glycosylation
（人类前胶原蛋白赖氨酸羟化与双糖基化的结构基础）
的研究论文，
利用冷冻电镜技术解析了由LH3和ColGalT1形成的赖氨酸残基修饰分子机器的多构象高分辨率结构并发现了多聚化酶纤维的形成，初步阐明了这一分子机器介导三个生化反应协调进行的分子机制，还进一步对该分子机器的疾病相关突变位点进行了定位测绘，揭示了赖氨酸修饰功能受损引发骨骼与结缔组织疾病的结构病理学原理。
图1. KOGG 2:2四聚体冷冻电镜结构（上）与LH3/ColGalT1二级结构组成（下）。
尽管此前有生化证据提示LH3与ColGalT1可能存在物理互作，本项研究系首次直接观察到催化赖氨酸O连接糖基化修饰完整加工链条的LH3与ColGalT1形成的分子机器，并命名为KOGG复合物
(
K
lys
-
O
-
G
alactosyl-
G
lucosyl)
。冷冻电镜分析显示，LH3从N末端至C末端由三个相对独立的结构域组成，分别是GlcT、AC与LH结构域。ColGalT1则相对较小，包含两个结构域，分别是N末端的GalT-N结构域和C末端的GalT-C结构域。LH3与ColGalT1首先各自分别形成长棒状的同二聚体，随后LH3与ColGalT1以各自二聚体中的一个单体相互结合，形成LH3-ColGalT1间的互作界面，从而产生一个2:2的四聚体复合物结构。在这个四聚体中存在三个互作界面：两个LH3蛋白之间通过LH结构域形成的LH3二聚化界面；两个ColGalT1之间通过GalT-N结构域形成的ColGalT1二聚化界面；ColGalT1的GalT-N结构域与LH3的GlcT/AC结构域为主体的LH3-ColGalT1界面。值得注意的是，尽管另一个ColGalT1分子远离LH3-ColGalT1界面，它柔软的N末端向该界面延伸并插入LH3的GlcT/AC结构域之间，从而加强了LH3-ColGalT1界面的稳定性。
在解析了KOGG复合物的基本架构之后，研究者深入分析了各个酶促反应中心的局部构象。在该复合物的全部五种结构域中，除LH3的AC结构域内部处于空载状态外，其它结构域全部可以发现反应产物或底物的电子密度存在。其中LH3蛋白的LH结构域结合有α酮戊二酸与铁离子，这是赖氨酸羟化所必须的反应物和辅因子；添加UDP半乳糖后的KOGG中，ColGalT1的GalT-N和GalT-C结构域中分别结合有锰离子、UDP半乳糖和UDP，后两者分别代表了羟赖氨酸半乳糖基化所需的反应物与产物之一；最后，通过添加UDP葡萄糖，研究者在LH3的GlcT结构域中发现了锰离子与UDP，这提示该结构域的高反应性使得结合的UPD葡萄糖很难保持稳定，只能获得反应产物的结构。这些酶促中心与反应物/辅因子/产物的局部构象获得，使得人们得以窥见分子机器加工过程的一些重要瞬间。
图2. KOGG复合物中各个酶结构域的底物/产物结合口袋与其中所结合的金属离子和参与反应的有机小分子。
由于LH3二聚体与ColGalT1二聚体仅仅通过一侧的单体酶分子形成异四聚体，因此另一侧的单体酶分子还保留着与另一个二聚体分子形成复合物的潜在能力，这意味着理论上四聚体形式的KOGG复合物可以通过形成新的LH3-ColGalT1界面来延伸形成更高聚合度的KOGG高聚物。研究者首先分别利用化学交联法和非变性凝胶电泳方法证实了高聚态KOGG的存在，随后利用优化的算法对冷冻电镜数据进行了进一步归类与分析，最终解析了包含更多LH3-ColGalT1结构单元的KOGG多聚化酶纤维。尽管生物学上KOGG复合物的基本单元是LH3二聚体+ColGalT1二聚体，在KOGG多聚化酶纤维中，最小的聚合单元模块为LH3-ColGalT1异二聚体，这一聚合单元利用LH3和ColGalT1的二聚化界面实现向两侧的延伸，最终产生多聚化酶纤维。这一多聚化蛋白质加工纤维的存在，提示在内质网中的赖氨酸糖基化是处于一个更为有序和复杂的组织度下进行的，而非简单的碰撞-催化过程。
图3. KOGG复合物的多聚化酶纤维状态示意图。每个红色直棒代表一个LH3二聚体，蓝色直棒代表一个ColGalT1二聚体。
KOGG复合物上出现的突变可能造成蛋白质加工修饰的缺陷，影响细胞内的蛋白质稳态平衡，最终导致细胞功能异常与疾病。首当其中最易受累的蛋白质便是胶原蛋白。由于胶原的成熟与细胞外基质的装配高度依赖其正确的翻译后加工，KOGG的功能失调可引发多种骨骼与结缔组织中胶原细胞外基质结构的紊乱，从而引起骨骼脆弱、发育迟缓、血管破裂等症状。根据已经报道的疾病相关突变遗传学信息，研究者在KOGG结构上对其进行标注，完成了胶原赖氨酸修饰相关疾病的突变位点测绘工作，为BCARD综合征、脑小血管病等相关疾病的分子病理学研究提供了结构见解。
该论文由上海交通大学医学院附属第九人民医院精准医学研究院与骨科的曹禹研究员、九院骨科与上海市运动系统退变与再生前沿科学基地的秦安研究员团队合作完成，第一作者为上海第九人民医院骨科彭俊讲博士、精准医学研究院博士后李文果以及上海市仁济医院的姚德强副研究员。本论文的完成得到了九院骨科赵杰主任的合作与支持。
曹禹课题组目前诚邀博士后/研究助理加入开展蛋白质稳态的分子机制研究，详情请访问曹禹实验室主页或来信咨询。
（http://www.shipm.cn/jyjz_web/html/DefaultSite/jyjz_syxz_cy_sysjj/List/index.htm）
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-57768-9
制版人： 十一
1 Wang, Y., Xu, A. M., Knight, C., Xu, L. Y. & Cooper, G. J. S. Hydroxylation and glycosylation of the four conserved lysine residues in the collagenous domain of adiponectin - Potential role in the modulation of its insulin-sensitizing activity.
Journal of Biological Chemistry
277
, 19521-19529 (2002).
https://doi.org/10.1074/jbc.M200601200
2 Heikkinen, J.
et al.
Lysyl hydroxylase 3 is a multifunctional protein possessing collagen glucosyltransferase activity.
J Biol Chem
275
, 36158-36163 (2000).
https://doi.org/10.1074/jbc.M006203200
3 Schegg, B., Huelsmeier, A. J., Rutschmann, C., Maag, C. & Hennet, T. Core Glycosylation of Collagen Is Initiated by Two beta(1-O)Galactosyltransferases.
Molecular and Cellular Biology
29
