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2024年5月发表在《Cell Reports Medicine》的研究文章：“全面的单细胞乳腺肿瘤图谱定义上皮和免疫异质性以及预测抗PD-1治疗反应的相互作用，A comprehensive single-cell breast tumor atlas defines epithelial and immune heterogeneity and interactions predicting anti-PD-1 therapy response”。
本文的通讯作者是美国癌症研究协会和癌症免疫治疗学会的成员Isaac Chan教授,他专门研究免疫疗法、乳腺癌和转移性癌症，以期找到更好的治疗和预防转移性疾病的方法。他的研究为我们提供了一种全新的视角，可以深入了解肿瘤微环境中不同细胞类型的异质性和相互作用，以更好地理解乳腺癌的细胞和分子组成，从而为乳腺癌的治疗提供更深入的认识。
一、摘要
作者提供了一个集成的原发性乳腺肿瘤微环境（TME）的单细胞RNA测序图谱，其中包含来自8个数据集的119个活检样本的236,363个细胞。在这项研究中，作者利用这一资源对免疫细胞和癌症上皮细胞的异质性进行了多重分析。作者通过乳腺TME中的6个亚群来定义自然杀伤（NK）细胞的异质性。由于NK细胞的异质性与上皮细胞的异质性相关，作者从单基因表达水平、分子亚型和反映肿瘤内转录异质性的10类等方面对上皮细胞进行了表征。作者开发了InteractPrint,，它考虑了癌症上皮细胞的异质性如何影响癌症-免疫相互作用。在两项测试新辅助抗pd-1治疗的乳腺癌临床试验中，作者使用T-cell InteractPrint来预测对免疫检查点抑制（ICI）的反应。与PD-L1相比，两种试验的反应（AUC = 0.82,0.83 vs. 0.50,0.72）。这种资源使对乳腺TME的额外高分辨率调查成为可能。
二、Highlights
图形摘要三、结果
1、乳腺癌样本的集成scRNA-seq数据集揭示了表现出不同功能特征的不同NK细胞亚群
来自8个公开数据集的88名患者119个样本的scRNA-seq数据，作者整合了所有临床亚型和广泛临床特征的总共236,363个细胞，使用UMAP可视化显示细胞按谱系聚类。结果显示与其他研究结果一致，免疫细胞和基质细胞群在临床亚型中聚集在一起，而上皮细胞则按亚型显示分离。由于 NK 细胞是抗肿瘤控制的关键介质，但是我们对NK细胞在乳腺TME中的不同表型和功能的理解是有限且不完整的，同时之前的研究中并没有解析人乳腺TME中的NK细胞亚群。为了解决这一差距，作者从集成数据集中重新聚类了NK细胞。发现了6个NK细胞簇，命名为 NK-0到 NK-5，气泡热图显示差异基因表达分析揭示了每个NK亚群的上调基因的表达。
之前在体外小鼠模型中，作者观察到NK细胞在暴露于恶性乳腺上皮细胞后可以被“重编程”，以促进肿瘤的生长。为确定这一发现的人类意义，根据之前实验，将原始签名转换为人类类似物，并将其应用于NK细胞子集。发现重编程的NK细胞与NK-1子集最相似，进一步的差异表达分析发现,NR4A家族、FOS、JUN和DUSP1是最差异表达的基因,与NK-1的上调基因一致,表明NK-1与rNK最相似。并且在患者样本中观察到，与亚型无关，rNK细胞的较高表达与年龄较大相关（R = 0.33，p < 0.01），rNK细胞特征的表达增加与较差的总生存期相关（p < 0.05），个体乳腺肿瘤具有不同程度的癌上皮细胞异质性，观察到NK细胞异质性与乳腺癌的某些临床亚型相关。
图1原发性乳腺癌的整合scRNA-seq数据集确定了乳腺癌中的6个NK细胞亚群2、个体乳腺肿瘤具有不同程度的癌上皮细胞异质性
通过以上分析，作者观察到NK细胞异质性与乳腺癌临床亚型相关。因此作利用这一资源以进一步了解乳腺TME和癌症上皮内临床相关的异质性。在单细胞分辨率下，作者量化了肿瘤中单基因表达(即ERBB2和TACSTD2)的异质性，发现所有乳腺癌亚型的大多数样本都表达ERBB2和TACSTD2,这与之前的研究报道一致。
为探究哪些临床相关的靶基因与ERBB2和TACSTD2表达相关,作者分析发现PIK3CA、ERBB3和FGFR在ERBB2Hi细胞中的表达最高。相比之下，TACSTD2和CD274在ERBB2Med细胞中的表达水平最高，而在ERBB2Hi细胞中的表达水平明显较低。通过分析与TACSTD2相关的靶基因，发现EGFR、CDK和NTRK在TACSTD2Hi细胞中的表达升高。此外，TACSTD2Med细胞高度表达NECTIN2,这是一种与TIGIT相关的配体,暗示了抗TROP2疗法和免疫检查点抑制的潜在协同作用。进一步的差异基因表达分析显示,CEACAM6、DUSP6和ITGB6在ERBB2Med细胞中上调,这与先前报道的它们在HER2+癌细胞中的表达一致;KRT14和KRT17在TACSTD2Hi细胞中显著上调,这些基因被认为是高度转移性乳腺癌细胞的标志。
在评估与临床特征的相关性时发现,在非HER2+肿瘤中,ERBB2表达细胞的比例与淋巴结状态无显著关联,然而表达TACSTD2的细胞比例增加的肿瘤与较高的淋巴结状态显著相关。接下来表征了原发性乳腺肿瘤中癌上皮细胞的ITTH。为此，作者使用分子亚型分类器对数据集中的癌症上皮细胞的四种分子亚型进行评分分类，结果发现,33.3%的样本存在分子亚型以外的其他因素导致的异质性,说明需要更高分辨率的方法研究癌症上皮细胞的肿瘤内异质性。
图2癌上皮细胞显示大量的肿瘤内转录异质性（ITTH）3、癌症上皮细胞异质性可以通过10组统一的基因特征来定义
为了开发异质性癌症上皮细胞的高分辨率分类器，作者首先对集成数据集中的所有癌症上皮细胞进行了无监督聚类，以生成上调基因的特征，这些基因捕捉了癌症上皮细胞簇的不同分子特征。接下来，根据 12 个临床治疗靶点的表达进行监督分类，以确保通过上调的基因特征捕获临床相关的关联。将这些基因再次聚类,确定了 10 个统一组，定义为 "基因元件"（GE）。根据单个 10 个 GE 对每个癌症上皮细胞进行评分。
评估分子亚型时发现,GE3标记的细胞主要被归为basal亚型,而大部分GE9标记的细胞被归为Her2亚型。进一步的富集分析显示,不同GE在生物学功能上具有异质性,并验证了该分类方法不受临床或分子亚型的限制。
为探究癌上皮细胞肿瘤异质性如何影响肿瘤微环境中的免疫相互作用,作者使用NicheNet预测GEs和免疫细胞的受体-配体配对,发现GE1和GE6与NK细胞的预测作用强度最大。验证发现,GE1和GE6表达的增加能显著降低NK细胞杀伤的敏感性。作者还观察到GE1和GE6癌上皮细胞与NK细胞形成抑制NK细胞活性的受体-配体对,验证了癌上皮细胞异质性对肿瘤微环境免疫相互作用的影响。
图3：肿瘤上皮细胞异质性可以通过影响免疫细胞相互作用的10个基因来定义4、基因的空间映射反映了预测的免疫相互作用
InteractPrint:为了解释肿瘤内的肿瘤上皮细胞ITTH如何影响免疫细胞的相互作用，作者开发了InteractPrint，这个方法反映了解码矩阵中主要的肿瘤应答免疫细胞与高度表达每种GE癌细胞之间的相互作用。
I-SPY2是一项正在进行的、多中心、开放标签、适应性随机的2期临床试验，用于治疗复发风险高的早期乳腺癌的新辅助化疗。
作者使用了空间转录组学数据集,将10个GE应用于每个样本,并使用InteractPrint推断哪些GE标记的细胞与T细胞相互作用。因此作者检测了GEs的共表达和邻近CD8+ T细胞的存在。结果显示在所有样本中，GE5的表达与CD8+T细胞呈正相关(平均R = 0.33, p<0.0001),并确定了CD8+T细胞与GE5表达共定位。
由于目前的免疫检查点抑制剂(ICI)是靶向CD8+ T细胞驱动的癌症，作者试图使用InteractPrint来表征治疗靶向免疫细胞在患者体内的主要免疫反应，因此开发了T细胞InteractPrint来预测谁可能对ICI有反应。
作者利用已知的一个单独的scRNA-seq数据集，该数据集包含乳腺癌患者在抗pd -1治疗前和后的肿瘤活检。将每个个体患者的肿瘤分解为10个基因，发现在抗pd -1治疗之前，有相当多的癌症上皮细胞ITTH,ROC曲线分析显示其在预测抗PD-1治疗响应者的能力。
接下来,作者将该方法应用于I-SPY2试验数据集,观察到的肿瘤异质性水平与前述数据集一致。同样地,T细胞InteractPrint在预测抗PD-1治疗反应方面显著优于癌细胞PD-L1表达。通过两个试验,突出了T细胞InteractPrint解码癌症上皮细胞ITTH如何影响每个患者的CD8+ T细胞反应的能力。
图4:GE-免疫相互作用预测抗pd -1治疗的反应四、结论
在这项研究中，作者利用8个公开数据集的119个活检样本的236,363个细胞创建了一个完整的乳腺TME scRNA-seq图谱。该资源能够分离原发性乳腺肿瘤内的细胞群，并在单细胞水平上对细胞异质性进行强有力的表征。这个集成的数据集在统计上比传统的原始源数据集的荟萃分析更强大，并且能够评估与临床特征的相关性。作者利用这一资源来定义免疫和癌症上皮细胞的异质性及其相互作用，这是第一次在乳腺癌中定义NK细胞亚群，并利用InteractPrint 的方法提供了癌症上皮细胞异质性影响免疫相互作用和抗PD-1治疗反应的证据。
这项研究的核心发现强调了综合分析肿瘤上皮细胞与免疫细胞异质性的重要性，这一方法显著提升了预测免疫治疗反应的能力，从而为精准医疗策略的制定开辟了新视角。此外，该研究还贡献了宝贵的单细胞数据资源，极大地促进了对乳腺肿瘤微环境复杂性的深入理解，未来可能会产生更多有影响力的发现。
常规套路，挖掘肿瘤新亮点
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