胰腺导管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要类型，是最致命的癌症之一，5年生存率低于10%，中位生存时间不到6个月。预计到2040年，它将成为癌症相关死亡的第二大原因。大部分胰腺癌一经发现已进入晚期，错失手术治疗的最佳时机，因此，开发可靠的早期诊断生物标志物和有效的靶向药物对改善预后至关重要。肿瘤微环境（TME）是最具代表性的癌症特征。PDAC TME 非典型地富含大量非恶性间质细胞和细胞外基质，这些成分与肿瘤细胞存在密切的相互作用，可促进其增殖、转移和耐药。基于质谱的蛋白质组学分析可以系统地探索 PDAC 细胞间信号转导过程，但目前的蛋白质组学研究大多在细胞水平或采用块状肿瘤样本开展，仅能获得平均化分析结果或难以全面揭示临床样本中真实功能蛋白质组特征。为此，田瑞军团队发展了临床功能蛋白质组学策略 TMEPro，该技术从底层原理出发，从湿实验和干实验两方面入手，采用多种蛋白质组学策略多维度解析肿瘤样本中功能蛋白质组特征，系统地解决了上述技术难题。
2024年11月13日，南方科技大学理学院化学系田瑞军教授团队联合国内外团队在Nature期刊发表题为Clinical functional proteomics of intercellular signaling in pancreatic cancer的研究论文，开发了多维度临床功能蛋白质组学分析策略并应用于系统解析胰腺癌肿瘤微环境中的细胞间信号转导网络，为发现新的胰腺癌标志物和药物靶点提供了系统功能蛋白质组大数据和新思路。
如图所示，临床功能蛋白质组学策略 TMTPro 分为五个纬度对同一微量肿瘤样本进行分析。S-PM 蛋白是细胞间信号转导的关键调控机器，也是最重要的生物标志物和药物靶点，因此，TMTPro 策略针对分泌蛋白和膜蛋白（简称 S-PM 蛋白）进行规模化分析。基于大部分 S-PM 蛋白都具高度糖基化的分子特征，本研究发展了基于双功能肼化学探针的糖蛋白标记策略同时富集这两类重要的功能蛋白。该策略在100例 PDAC 等临床组织样本中共鉴定了近3000种 S-PM 蛋白，覆盖了近一半左右的人类蛋白组中已知的 S-PM 蛋白质组，并鉴定了大量已知的癌症生物标志物和药物靶点。总而言之，研究者构建了目前最大规模、覆盖最全面的 S-PM 蛋白组大数据集，为研究胰腺癌细胞间信号转导网络和发现新的胰腺癌生物标志物和药物靶点提供了坚实的大数据基础。
为进一步解析 S-PM 蛋白质组的细胞类型来源和细胞间信号转导流向，研究者开发了空间可视化蛋白质组学分析策略，系统地分析了13例 PDAC 肿瘤组织样本癌细胞区域和基质细胞区域，得到了目前最大的 PDAC 空间蛋白组数据集。上述数据集可实现对 S-PM 蛋白质组中近80%蛋白的细胞类型定位注释，其中细胞外基质通路相关蛋白主要富集于间质细胞，而绝大多数转运体相关蛋白则是来源于癌细胞。研究者系统分析了两种细胞类型间的信号转导网络，共鉴定了260余对癌细胞与基质细胞间的旁分泌配体-受体膜蛋白信号轴。
为解析 S-PM 蛋白组随胰腺癌演进的动态变化趋势，研究者收集了 PDAC 经典转基因动物模型 KPC 小鼠早中晚期的样本进行时间维度的定量 S-PM 蛋白组分析。通过系统比较人源数据与 KPC 小鼠数据中显著性变化的蛋白，研究者发现大部分蛋白具有一致的变化趋势，首次从组学层面证明了 KPC 小鼠在 PDAC 功能蛋白质组学研究中的合理性。更为重要的是，上述组学数据的聚类分析揭示 S-PM 蛋白质组具有三种显著的变化趋势。其中，众多已报道的癌症标志物和药物靶点主要集中在中晚期才开始上调的数据集中，揭示了晚期胰腺肿瘤中活跃的细胞间信号转导网络；而在肿瘤发展早期就显著上调的数据集，为发现新的早癌筛查标志物和药物靶点提供了重要的临床大数据资源。
酪氨酸磷酸化（pTyr）是细胞间信号转导网络激活的重要特征。异常的 pTyr 与肿瘤发生发展密切相关。为尽可能全面解析微量肿瘤组织样本中的 pTyr 蛋白质组，研究者通过两种蛋白质组学策略进行分析。首先，团队通过前期开发的三功能化学交联探针，实现对 pTyr 修饰蛋白和相互作用蛋白的定量蛋白质组学分析；其次，通过高选择性直接富集 pTyr 多肽实现高灵敏度 pTyr 位点鉴定。这两种策略的联合分析，实现了对 pTyr 蛋白质机器中酪氨酸激酶、酪氨酸磷酸酶以及酪氨酸磷酸化结合蛋白深度解析，并发现该蛋白质机器在胰腺癌中普遍高度激活，为细胞间信号转导网络的系统解析提供了关键功能维度数据。
研究者对上述四个维度的蛋白质组学数据进行了系统的多维度整合分析，构建了胰腺癌肿瘤微环境中癌细胞和间质细胞的双向分泌配体-受体膜蛋白-下游功能蛋白信号轴，共解析出1600多种关键的细胞间信号轴。研究者挑选了 PDGF-PDGFR 介导的从肿瘤细胞到间质细胞的旁分泌信号轴进行验证，证明上述临床功能蛋白质组数据的可靠性。令人意外的是，研究者通过进一步功能蛋白质组学分析发现了一个新的癌细胞-间质细胞互作的双向信号环路，即癌细胞分泌的 PDGFs 通过激活 CAFs 细胞的 PDGFR-PTPN11-ERK-FOS 信号通路，调控 CAFs 细胞分泌配体蛋白 LIF 的表达和分泌，进而激活癌细胞的 LIFR-GP130-STAT3 通路。而研究者于2019年共同发表的 Nature 文章发现了 LIF 在胰腺癌中的重要生物学功能，并系统证明其成为有效的治疗靶点以及肿瘤诊断标志物的光明前景。值得一提的是，首个中和性 LIF 抗体靶向治疗正在进行美国 FDA 批准的二期临床实验。
最后一个维度的 TMEPro 分析是基于创新预测算法的肿瘤微环境中膜蛋白胞外区脱落分析。该分析源于 TMEPro 分析策略发现数百种显著性变化蛋白酶，进而成功地预测了22种高可信的发生膜外区酶切脱落的膜蛋白。作者对发生酶切脱落最为显著的受体酪氨酸激酶 AXL 进行了系统地验证，并发现 MMP1 和 MMP11 是胰腺癌肿瘤中特异性调控 AXL 等膜蛋白胞外域脱落的蛋白酶。
由于 AXL 与肿瘤进展密切相关，且其激酶抑制剂已经进入美国 FDA 批准的胰腺癌二期临床试验，研究者对这一意外发现的额外维度的细胞间信号转导轴进行了系统的功能研究。其开发了空间糖蛋白质组学分析流程，并对50例肿瘤组织中 AXL 胞外域、AXL 完整蛋白及其分泌配体蛋白 GAS6 实现了极具挑战的绝对定量分析。上述分析揭示约70%的 AXL 都发生了胞外域脱落，并发现当脱落的 AXL 量小于其配体 GAS6 时，病人更趋向于发生转移。更重要的是，研究者通过靶向酪氨酸磷酸化蛋白质组学分析等系统证明游离的 AXL 可以极高亲和力地结合 GAS6，进而显著抑制 AXL 信号通路的激活。此外，研究者在66例 PDAC 类器官的联合给药实验中发现联合抑制 AXL 的激酶活性和蛋白酶介导的胞外域脱落具有显著的协同效应（另外近百例未发表的 PDAC 类器官结果也系统证明这一结果），并在小鼠移植瘤和原位瘤模型中得到了验证。
总而言之，基于该项研究所开发的多维度临床功能蛋白质组学分析策略 TMEPro，以及一个交互式数据检索网站TMExplorer，不仅为系统解析肿瘤等组织微环境中的细胞间信号转导网络提供了新颖的系统水平功能蛋白质组学分析工具，还为探寻胰腺癌治疗和诊断的分子靶点提供了重要的大数据集。此外，本研究所发现的细胞间信号转导回路和基于定量空间糖蛋白质组学分析的额外维度细胞间信号转导调控有望为胰腺癌靶向药物临床研究提供有益线索。
南方科技大学为论文第一单位。南方科技大学研究学者黄培武、研究助理教授高伟娜（现为深圳市贝普奥生物科技有限公司CTO）、研究助理教授付常英、华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科王敏教授、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心助理研究员李允广为本论文共同第一作者。田瑞军教授为本工作的主要通讯作者，同济医院秦仁义教授、分子细胞卓越中心高栋研究员、美国索尔克生物研究所史宇博士（现为美国百时美施贵宝公司资深研究员）为本文的共同通讯作者。美国科学院 Tony Hunter 院士为本研究提供了指导。
https://www.nature.com/articles/s41586-02408225-yhttp://bioinfo.chem.sustech.edu.cn/TMExplorer_Beta/user-login.jsp
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