湖南大学黄晋课题组Sci. China Chem.：工程化自分解核酶纳米球实现协同抗癌治疗

基因调控治疗是近年来备受关注的疾病治疗策略之一。尽管 DNA 酶在体外显示出高 mRNA 切割活性，但在体内应用面临挑战，包括细胞穿透难、金属离子依赖性及单药治疗效果不佳等问题。多种载体已被开发用于基因治疗，其中 DNA 纳米材料因其生物相容性、稳定性和载药能力受到更多关注。近期， 湖南大学化学化工学院黄晋教授 与合作者 开发了一种创新的自分解 DNA 酶纳米球（ Apt-SCNS-Dox-ZnO ），不仅能实现高效细胞穿透和药物递送，还能在细胞内触发三重抗癌疗法。相关研究成果发表在 Science China Chemistry （ DOI: 10.1007/s11426-024-2095-6 ），论文的第一作者为 湖南大学博士研究生 陈余， 通讯作者为中南大学湘雅医院 蒲颖博士后 、湖南大学化学化工学院 石慧 副教授 和 黄晋 教授 。

基于 DNA 酶的基因治疗面临一些挑战，包括细胞穿透、活性限制和协同递送功能。自组装的 DNA 纳米药物因其多种优势而受到广泛关注，亟需开发一种通用的 DNA 降解策略以实现精确的可编程药物释放。 内置 DNA 酶纳米球的设计作为基因治疗的智能载体极具吸引力。

在此，作者提出了一种通用的 DNA 酶纳米球设计，只需要传统的切割 RNA 的 DNA 酶链，不仅可以作为 DNA 纳米球解体的驱动力，还可以作为基因治疗的试剂。此外，这种智能 DNA 酶纳米球的新设计可以同时实现细胞穿透、活性增强和协同递送功能。 如图 1 所示，自催化 DNA 酶纳米球（ SCNS ）被设计用于协同抗癌治疗。具体而言， SCNS 通过三条 单链 DNA 链（两条 DNA 酶链和一条底物链） 形成的 Y 型 DNA 逐步杂交组装而成，随后负载了适配体（ Apt ）、阿霉素（ Dox ）和氧化锌纳米颗粒（ ZnO NPs ）。酸触发的 ZnO NPs 解离导致生成 Zn ²⁺ 辅因子，从而立即激活 SCNS 。 SCNS 解离后，三种类型的抗癌治疗被激活，包括 Zn ²⁺ 参与的活性氧（ ROS ）生成、 Dox 诱导的化疗和基于 DNA 酶的基因治疗，从而同时实现化疗、基因治疗和化学动力学治疗，达到高效抗癌效果和最小的副作用。

图 1. Apt-SCNS-Dox-ZnO 的自组装和解体的示意图： 在细胞溶酶体中，酸触发 ZnO 解体，诱导 Apt-SCNS-Dox-ZnO 解离释放药物，从而实现化疗 / 化学动力学 / 基因协同治疗。 （图源： Science China Chemistry ）

作者首先通过琼脂糖电泳验证了 SCNS 的成功合成（图 2b ）。 TEM 显示， SCNS 呈球形，且尺寸相对均匀（图 2c ）。通过 zeta 电位和粒径表征进一步证实了 SCNS-Dox-ZnO 的成功合成。结果显示 Dox 的加载未显著改变 zeta 电位和粒径。然而， ZnO NPs 的整合导致 SCNS-Dox-ZnO 的电位增加和粒径略微增加（图 2d 、图 2e ）。

图 2. SCNS-Dox-ZnO 的自组装 。（ a ） SCNS-Dox-ZnO 自组装的示意图。 （ b ） 2% 琼脂糖凝胶电泳分析 SCNS 的自组装。 1: Y1, 2: Y2, 3: Y3, 4: SCNS 。 （ c ） SCNS 的透射电子显微镜 (TEM) 图像。 （ d ） Zeta 电位分析。 （ e ） 动态光散射 (DLS) 分析。

接下来作者研究了 SCNS-Dox-ZnO 的解组装 ， SCNS 与 Zn ²⁺ 孵育后可以观察到裂解产物的 DNA 带，而非自分解纳米球（ nSCNS ）则没有（图 3b ）。 SCNS-Dox 与 Zn ²⁺ 孵育后释放的 Dox 的荧光进一步证实 SCNS 的解组装（图 3c ）。当 Zn ²⁺ 浓度达到 8 mM 时， DNA 酶的裂解效率最高（图 3d ）。在 pH 5.0 时， SCNS-Dox-ZnO 可以在 6 小时内释放 73.83% 的药物，而在 pH 7.4 时仅释放 22.62% 的药物（图 3e ）。此外，电感耦合等离子体质谱（ ICP-MS ）分析表明， ZnO NPs 的解离是酸响应的， nSCNS-Dox-ZnO 在酸性条件下可以解离 Zn ²⁺ ，但不能引起 nSCNS 的自裂解和 Dox 的释放。

图 3. SCNS-Dox-ZnO 的解组装。 (a) Zn ²⁺ 介导的 SCNS-Dox-ZnO 解组装示意图。 (b) SCNS 和 nSCNS 受控解体的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分析。 (c) Zn ²⁺ 介导的 SCNS-Dox 药物释放的荧光光谱。 (d) 不同浓度 Zn ²⁺ （ 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 mM ）条件下 SCNS 的 PAGE 分析。 (e) SCNS-Dox-ZnO 在 pH 7.4 或 pH 5.0 条件下的时间依赖性 Dox 释放曲线。 (f) SCNS-Dox-ZnO 和 nSCNS-Dox-ZnO 在缓冲溶液（ pH 5.0 或 pH 7.4 ）中 Zn ²⁺ 释放的 ICP-MS 分析。 （图源： Science China Chemistry ）

随后，作者在 MCF-7 细胞中研究了 SCNS 纳米复合物的内化和细胞杀伤。 CLSM 结果显示， Apt-SCNS-ZnO 在 MCF-7 细胞中的摄取效率（图 4a ）高于正常细胞（ L02 ）（图 4b ）。此外，溶酶体共定位结果显示 Apt-SCNS-ZnO 可以从溶酶体逃逸到细胞质（图 4c ）。这有助于提高 Apt-SCNS-Dox-ZnO 的细胞进入效率和后续药物释放效率。接下来作者研究了 Dox 的释放行为，结果表明 Apt-SCNS-Dox-ZnO 可以成功进入 MCF-7 细胞，并实现药物的有效释放（图 4d 和图 4e ）。细胞内 Zn ²⁺ 的浓度对于 SCNS 的解体和抗癌治疗至关重要。 ICP-MS 分析结果表明，在 Apt-SCNS-Dox-ZnO 处理后，细胞内 Zn ²⁺ 的浓度显著升高，这足以激活 DNA 酶介导的 SCNS 自我裂解和下游 survivin mRNA 降解。

图 4. 细胞摄取和药物释放 。 (a) SCNS-ZnO 和 Apt-SCNS-ZnO 在 MCF-7 细胞中的细胞摄取。 (b) SCNS-ZnO 和 Apt-SCNS-ZnO 在 L02 细胞中的细胞摄取。 (c) Apt-SCNS-ZnO 的溶酶体逃逸。 (d) MCF-7 细胞中 Apt-SCNS-Dox-ZnO 和 Apt-nSCNS-Dox-ZnO 的药物释放。 (e) 使用 Image J 对 (d) 中的 Dox 平均荧光强度 (MFI) 进行分析。 (f) 通过 ICP-MS 定量分析 MCF-7 细胞中 Apt-SCNS-Dox-ZnO 处理后的细胞内 Zn ²⁺ 。（ ***p<0.001 ， t 检验计算）。 （图源： Science China Chemistry ）

为了证明基因治疗的有效性，作者选择 survivin mRNA 作为裂解目标。 survivin mRNA 在大多数癌症中高度表达，沉默其基因可以促进细胞凋亡，从而抑制癌症。 qRT-PCR 和 Western blot 分析结果显示， Apt-SCNS-Dox-ZnO 对 survivin mRNA 水平和蛋白表达水平具有最强的抑制作用（图 5a ）。除了 DNA 酶裂解细胞内的 survivin mRNA ， Dox 还可以进一步抑制与凋亡相关的基因表达。此外，在 Apt-SCNS-ZnO 处理的 MCF-7 细胞中，观察到显著 ROS 产生（图 5b ）。接着作者研究了纳米复合物的体外治疗效果，结果证实 Apt-SCNS-Dox-ZnO 对 MCF-7 细胞的杀伤效果最强（图 5c ）。活 / 死染色结果进一步表明， Apt-SCNS-Dox-ZnO 组通过三重协同治疗效果导致显著的细胞损伤，观察到了最强的红色信号（图 5d ）。此外，细胞凋亡结果进一步显示， Apt-SCNS-Dox-ZnO 处理的 MCF-7 细胞导致最高比例的凋亡。上诉结果证实了 Apt-SCNS-Dox-ZnO 对目标 MCF-7 细胞具有高效杀伤作用。

图 5. 体外协同治疗效果 。 (a) 不同处理后 MCF-7 细胞生存素水平的 Western blot 和 qRT-PCR 分析。 a: PBS, b: Apt-SCNS, c: Dox, d: ZnO NPs, e: Apt-SCNS-Dox-ZnO, f: Apt-SCNS-ZnO, g: Apt-nSCNS-Dox-ZnO 。 (b) Apt-SCNS 或 Apt-SCNS-ZnO 存在下细胞内 ROS 的 CLSM 图像。 (c) 不同处理后 MCF-7 细胞的体外癌细胞杀伤效果。（ *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ， t 检验计算）。 (d) 不同处理后 MCF-7 细胞的活 / 死细胞染色。 (e) Annexin V-FITC/Rednucleus II 染色后，不同处理后 MCF-7 细胞的流式细胞术凋亡分析。 （图源： Science China Chemistry ）

最后在活体中验证了纳米复合物的协同治疗效果。在治疗期间，小鼠体重没有显著变化，表明这些纳米药物具有生物安全性（图 6c ）。肿瘤生长曲线、小鼠的肿瘤质量和图片表明， Apt-SCNS-Dox-ZnO 组的肿瘤生长最为缓慢（图 6d ， 6e 和 6f ），联合治疗可以有效抑制肿瘤生长。另外免疫组化结果显示 Apt-SCNS-Dox-ZnO 处理的肿瘤组织中的 survivin 水平显著受到抑制（图 6g ）。肿瘤 H&E 染色显示， Apt-SCNS-Dox-ZnO 组具有严重的纤维化、不完整的细胞形态和最小的核崩解（图 6h ）。这些结果表明， Apt-SCNS-Dox-ZnO 组具有最佳的治疗效果，这表明 Apt-SCNS-Dox-ZnO 促进了癌细胞的凋亡，并且含有辅因子的级联 DNA 酶提高了基因沉默效率，下调了 survivin 蛋白表达。作者还评估了纳米材料的生物安全性。结果显示纳米材料具有良好的生物相容性和安全性，并且可以通过肝脏和肾脏排泄从循环中清除，没有系统或组织水平的毒性。

图 6. 体内协同治疗效果 。 (a) 建立 MCF-7 肿瘤异种移植模型和治疗过程的方案。 (b) 不同制剂的抗肿瘤机制和效果示意图。 DZ: DNA 酶； Sur: