研究生一作，医科大学发 Nature

生物学霸 · 公众号 · 生物 · 2024-08-19 18:02

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来源：天津医科大学

近日，天津医科大学基础医学院生化系、天津市免疫学研究所张恒团队联合中国科学院武汉病毒所邓增钦团队，在 Nature 期刊发表了题为 "Structural basis for the activity of the type Ⅶ CRISPR-Cas system" 的研究论文，揭示了Ⅶ型 CRISPR – Cas 系统的生物学功能和分子机理，也为更安全、更精准地治疗人类相关疾病提供了可能性。

根据 Cas 效应蛋白的不同，可将其分为 2 大类共七型。其中，第 1 类系统由多个效应蛋白与向导 RNA 组成复合体行使功能，包括Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅶ型；第 2 类系统由单个效应蛋白与向导 RNA 形成复合体，包括Ⅱ，Ⅴ和Ⅵ型。目前，Ⅰ–Ⅵ型系统的功能和机制研究相对深入，然而，Ⅶ型作为一种候选 CRISPR-Cas 系统，其生物学功能和分子机理此前尚不清楚。

团队研究发现，与其它 1 类 CRISPR 系统的显著区别是，候选的Ⅶ型 CRISPR 复合体对核酸酶（Cas14）的招募依赖于底物 RNA 与 crRNA 序列的互补配对（图 1）。细胞功能实验进一步证实，这一复合体能够序列特异性识别细胞内转录本，靶向敲低基因表达，并能够对抗噬菌体对宿主大肠杆菌的感染（图 1），是具有适应性免疫功能的真正 CRISPR 系统。底物 RNA 依赖的复合体组装使这一系统有可能被进一步开发成为高精准可编程的 RNA 靶向编辑工具。

图 1 Ⅶ型 CRISPR – Cas 系统的 RNA 靶向识别与切割。a, Ⅶ型系统可特异性敲低红色荧光蛋白和卡那霉素抗性基因的表达；b, Ⅶ型系统可抵御 RNA 噬菌体 MS2 的感染；c, 核酸酶 Cas14 与 Cas5-Cas7-向导 RNA 的结合依赖于靶点 RNA 的存在；d, Cas14 的 RNA 酶活性。

为阐明Ⅶ型 CRISPR-Cas 系统切割底物 RNA 的分子机制，并进一步探究其应用于基因编辑的可能性，团队对宏基因组来源的Ⅶ型系统复合体进行了生化表征及结构解析，共得到 7 种不同功能状态的高分辨电镜结构（图 2）。这一分子量超过 500 kDa 的复合体由 7 个 Cas7 蛋白、1 个 Cas5 蛋白、4 个 Cas14 蛋白以及 crRNA 和底物 RNA 构成（图 2）。与其它 CRISPR 系统不同，Ⅶ型系统通过一种独特的核酸酶 Cas14 执行切割底物 RNA 活性，对单链和双链 DNA 无切割作用。Cas14 在溶液中形成四聚体，具有 Zn2+依赖的 RNA 内切酶及 5' 到 3' 外切酶活性。

图 2 Ⅶ型 CRISPR–Cas 复合体底物结合状态 I 的密度图 (a) 和结构模型 (b)

底物靶序列两侧的序列（protospacer flanking sequence，PFS）的存在往往限制了 CRISPR 工具对靶点的选择性。团队通过功能研究和结构验证，发现Ⅶ型系统区别于其它 CRISPR – Cas 系统的另一个特点是，3'-PFS 对底物切割无影响，5'-PFS 则可以通过增加Ⅶ系统复合体中 Cas14 的结合位点影响对 RNA 底物的切割。基于以上细胞功能、生物化学和结构生物学研究，团队较为深入的阐明了Ⅶ型系统的工作机理和结构基础（图 3）。Ⅶ型系统的以上三个独特之处，使其有可能成为非常有潜力的新型 RNA 编辑工具。

图 3 Ⅶ型 CRISPR – Cas 系统的工作机理

靶向 RNA 的 CRISPR 工具的一个主要特点是可编程性，它可以直接编辑或降解突变的 mRNA，精准地纠正基因表达异常。与 DNA 编辑不同，RNA 编辑不产生永久性基因改变，这减少了脱靶效应和潜在的副作用，使其更具安全性，为开发精准医疗提供了新方法。因此Ⅶ型 CRISPR 编辑工具对药物开发以及临床治疗具有巨大的潜在价值。综上，该研究首次对Ⅶ型 CRISPR–Cas 系统的功能进行了表征，深入阐明了这一系统独特的组装机制、底物 RNA 识别和切割模式，为基于Ⅶ型 CRISPR 系统的 RNA 操控工具在生物技术应用中的设计与开发奠定了基础。

天津医科大学张恒教授和武汉病毒所邓增钦研究员为论文的共同通讯作者。天津医科大学基础医学院杨洁博士、研究生李徐梓超、何秋秋、王枭燊、王童谣和武汉病毒所研究生唐晶晶为该论文共同第一作者。另外，天津医科大学基础医学朱宪彝班本科生张淑琴和刘志坤作为研究团队的重要成员，负责实验设计和结果分析，为研究的顺利进行作出了突出贡献。该研究得到了国家自然科学基金、天津市自然科学基金、中国科学院「百人计划」项目的支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07815-0