动物细胞培养基的前世今生

细胞作为高等生物最小的生命组成单元之一，是系统研究生命机理最有效的途径。 动物细胞培养（animal cell culture）是指从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖的一门技术。

纵观整个百年现代生物技术的发展历史，体外动物细胞培养可以说是支撑现代医学的核心技术。从最初的细胞仅能在体外存活几个小时，到可以连续增殖以供基础医学研究，自至今天成为“细胞工厂”（Cargo）为人类生产重组药物，再到未来也许可以被充分调控分化以细胞本身作为药物，可以说整个细胞培养技术的进步则代表了生物医学的发展方向。

由于动物体内的组织液和血液等为组织细胞的生长提供了充分的营养，因此体外细胞培养过程中营养液的合理提供，将是细胞培养能否成功的第一步关键因素。本文将结合生物医学的发展阶段，简要阐述动物细胞培养基的研发历程。

1882-1907 ：破晓

1882 年， Sydney Ringer 开发出一种盐溶液，可以让离体的青蛙心脏保持跳动，这也就是 Ringer 平衡盐溶液（ Ringer’s solution ）。这被认作是第一次实现动物组织的体外培养。 Ringer 的发现引发了一系列平衡盐溶液的开发： Locke’s solution 、 Tyrode’s solution 、 the Krebs–Ringer bicarbonate solution 、 Gey’s solution 、 Earle’s solution 和 Hanks’ solution 等。这些平衡盐溶液成分比较简单，以无机盐为主，优势加入葡萄糖作为营养，调节到生理 pH 即可维持组织或细胞的体外存活，通常在几天左右。

▲ Sydney Ringer ， 1835-1910

Ringer 成功实现组织的体外培养后，研究者开始聚焦细胞的体外培养。然而，细胞通常很难存活并且几乎没有分裂的迹象。直到 1907 年， Ross G. Harrison 利用青蛙淋巴囊分离的淋巴液培养青蛙神经纤维，发现其在数周时间内持续生长。该实验被认为是动物细胞体外培养的开端。

▲ Ross G. Harrison ， 1870-1959

1907- ：天然培养基

Alexis Carrel 是一名法国外科医生和生物学家、生物学家，因为对血管结构的研究和血管 / 器官移植的研究获得 1912 年诺贝尔生理学或医学奖。 Alexis Carrel 对组织培养的贡献巨大，他发明了一种直到今天仍在广泛使用的细胞培养瓶的原型瓶，并建立了一整套的无菌操作技术。

▲ Alexis Carrel ， 1873-1944

受 Harrison 成功培养神经纤维的影响， Alexis 在 1909 年派自己研究所（ Rockefeller Institute for Medical Research ）的下属 Montrose T. Burrows 到 Harrison 处（耶鲁大学）学习。在耶鲁大学， Burrows 发现淋巴液不适合培养恒温动物的细胞，于是改用血浆代替。从此，血浆成为细胞培养的主流培养基。 Burrows 成功的培养了鸡胚细胞和动物细胞。 1912 年， Carrel 证明通过周期性更换培养基可以实现鸡胚胎结缔组织的长期培养（长达几个月）， 1913 年， Carrel 发现通过添加胚胎提取物可以极大刺激鸡胚心脏成纤维细胞的增殖并大幅延长存活时间。同时，由于淋巴液、血浆、胚胎提取物的成分未知，研究者开始研究哪种成分影响了细胞的存活和增殖。

学界通常认可 Carrel 是第一个实现动物体细胞体外培养的人，美国国家科学院则认为之前的 1908 年，完成猪骨髓细胞培养的 Margaret Reed （后来成为 Warren H. Lewis 的夫人）为第一人。

1911- ：合成培养基的努力

1911 年， Margaret R. Lewis 和 Warren H. Lewis 夫妇证明：在 Locke 平衡盐溶液加入额外的氨基酸、肉汤、葡萄糖后改良而来的 Locke–Lewis solution ，可以更有效的促进鸡胚细胞的生长。他们指出，葡萄糖的作用非常重要，如果浓度不足，细胞就会在几天内萎缩和死亡。同时有研究人员证实了氨基酸和谷胱甘肽在鸡胚成纤维细胞培养中的作用，假说认为谷胱甘肽维持了氧化还原环境。 Joilannes P. M.Vogelaar 和 Eleanor Erlichman 发现了胰岛素、甲状腺素的重要作用，通过加入这两种激素以及葡萄糖、血浆、蛋白胨等到 Ringer 平衡盐溶液中，可以培养人成纤维细胞 3 个月以上。再如 Baker 培养基包含微生物 A 、维生素 C 、维生素 B1 、维生素 B2 、谷胱甘肽和血浆等。所有这些研究都使用了天然成分。

1940- ：细胞系的诞生

体细胞体外培养经过有限代次的分裂后，最终将死亡（ Hayflick limit ）。 1940 年， Wilton R. Earle 等人成功得到了永生的鼠成纤维细胞（ L cells ）； 1951 年， George O. Gey 和同事成功从宫颈癌患者分离得到了无限分裂的人细胞系（ Hela cells ）。有了这些细胞系，就不再需要每次试验都进行细胞的分离，而使用同样的细胞系进行试验。这也为衡量不同培养基组分对细胞的微小影响并进行定量分析带来了可能。从此刻开始，培养基的研究取得了快速的进展。

▲ 海瑞塔·拉克斯 Hela 细胞系来源

1946- ：基础培养基和无蛋白培养基

Baker 培养基和其他培养基都含有天然成分，为了确认到底哪些物质是细胞培养的必要成分，研究者通过两种策略来分析：一种是将血浆进行透析至分离出最小营养成分，然后加入不同化学成分分析刺激增殖的能力，另一种策略是不依赖于血浆，直接利用化学限定的成分来配制培养基。

Fischer 是第一种策略的先锋，他将血浆中低分子组分分离出来，发现去除低分子的血浆不能很好的维持细胞生长，随后 Fischer 发现氨基酸是低分子组分中维持细胞生长的必要成分。

随后生命科学进入井喷发展期，上世纪50年代注定是整个现代生命科学的起源。先是1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次。

随后的1955年，Harry Eagle采 用 Fischer 的方法，确认低分子组分中 13 种氨基酸和 8 种维生素是必要成分。在此基础上， Eagle 发明了 minimum essential medium (MEM) 培养基，包含葡萄糖、 6 种无机盐、 13 种氨基酸、 8 种维生素和透析血浆。 此培养基正式揭开了细胞培养基的研究序幕，直至今日仍然广泛应用于相关领域。

▲ 1955年Harry Eagle的研究成果发表在Science上

在Eagle的基础上，Renato Dulbecco、Marguerite Vogt、Clifford P. Stanners、Norman N. Iscove及Fritz Melchers等针对不同细胞系、不同培养目的对MEM培养基进行了优化。 Dulbecco进一步优化的dulbecco's modified eagle medium （DMEM）成为目前基础研究中应用最为广泛的培养基,是所有生物制药工程细胞用培养基的研究基石。 这位意大利后裔的美国人基于在肿瘤病毒上的出色研究获得了1975年的诺贝尔医学或生理学奖。

在随后的1957年中，美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得一株 上皮贴壁型细胞，这就是此 后成为生物制药上最广泛使用的CHO细胞。

毫不夸张地讲，没有Eagle、Dulbecco和Theodore T. Puck三人在1950年代的共同研究成功，今天全球接近1000亿美金的抗体药物产业化只能是纸上谈兵。

▲ In 1973 ，Columbia University wawarded Louisa Gross Horwitz Prize to Harry Eagle\Renato Dulbecco\Theodore Puck

采用 Fischer 方法， Thomas A. McCoy 等人发现 carcinosarcoma 细胞需要丙酮酸。同一时间， Roswell Park Memorial Institute （ RPMI ）修改了 McCoy 的 5A 培养基的配方，根据钙离子、镁离子浓度命名为 RPMI 1640 培养基，用于淋巴细胞的培养。

另一种完全避免血浆和蛋白的研究策略始于 1946 年， Philip R.White 发明了一种含有无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、铁离子、谷胱甘肽的培养基，完全不含蛋白成分。他用这种培养基成功培养鸡胚成纤维细胞和心肌细胞长达 2 个月。其他研究者则提出质疑，因为无法重复这个结果，除非加入 10-20% 的血清成分才能培养这么长的时间。 1950 年， Raymond C. Parker 领导的 Connaught Medical ResearchLaboratories (CMRL) 开发了 199 号培养基，成分在 White 培养基的基础上加入了脂溶性维生素、胆固醇、核酸前体。利用 199 号培养基，鸡胚细胞可以存活 3-4 周，但原代培养仍需加入血清。 CMRL 随后又通过提高还原性物质（半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素 C ）的浓度、加入辅酶、去除脂溶性维生素等得到含 58 种成分的 CMRL1066 培养基。 Wilton R. Earle 领导的 National Cancer Institute’sTissue Culture Section (NCTC) 开发了含有 68 种成分的 NCTC109 培养基。鉴于这两种培养基成分过于复杂而难于制备， Charity Waymouth 开发了含有 40 种成分的 752/1 培养基，成分包括葡萄糖、无机盐、氨基酸、维生素、嘌呤碱基、次黄嘌呤、谷胱甘肽。这 3 种培养基都是针对 L cells 设计的，不适合其他细胞的培养。同时，无蛋白培养基始终无法实现细胞克隆。

1963 年，