Nature Communications！彭海琳课题组成功实现多种蛋白近原子级分辨率的三维结构解析

近日，北京大 学彭海琳课 题组与合作者发表了题为 “Self-assembled superstructure alleviates air-water interface effect in cryo-EM” 的研究论文 ( Nature Communications . 2024 , 15, 7300) ，报道了基于石墨烯 - 硬脂酸分子自组装层复合结构 (GSAMs) 的冷冻电镜载网，该复合结构在冷冻制样时显著抑制了生物蛋白分子因吸附在气液界面而导致的结构变性和优势取向问题。同时， GSAMs 能显著丰富蛋白分子在无定形冰中的取向，有利于实现单颗粒冷冻电镜的高分辨结构解析。 通过 GSAMs ，研究团队成功实现多种蛋白近原子级分辨率的三维结构解析。

单颗粒冷冻电镜是目前揭示生物大分子精细结构和反应机理的重要手段之一。在冷冻电镜成像过程中，生物大分子被封装在薄层玻璃态冰中，在电子束辐照下，仍处于原始结构和本征状态。然而对于蛋白质而言，绝大多数蛋白质颗粒在冷冻制样时均倾向于吸附在空气 - 液体的界面处。吸附在气液界面的样品容易发生结构变性，并产生单一的优势取向，严重制约蛋白质的高分辨结构解析。为解决这个难题，业内通常引入一层无定形碳膜以避免气液界面问题，但是无定形碳膜厚度高达 3 nm ，在电镜下背景噪音大，并且电子辐照时会产生较大的样品漂移，显著降低成像质量。

近年来，北京大学彭海琳课题组致力于开发单原子层厚度的石墨烯功能薄膜及其电镜载网技术，清华大学王宏伟课题组致力于发展新型冷冻电镜成像方法及机理研究。双方强强联合，基于悬空石墨烯功能膜解决冷冻电镜成像存在的气液界面、优势取向、冰层控制、样品飘移等问题，以提升冷冻电镜成像分辨率，取得了一系列研究成果 ( Adv. Mater. 2017 ; Structure 2017 ; J. Am. Chem. Soc. 2019 ; Nature Commun ications . 2019 ; Nature Commun ications . 2020 ; Biophysics Reports 2021 ; ACS Nano 2021 ; Nature Commun ications . 2022 ; Nat. Methods 2023 ; J. Am. Chem. Soc. 2023 ) 。 2024 年 1 月，王宏伟课题组和彭海琳课题组进一步合作开发了一种基于石墨烯“三明治”结构的冷冻电镜生物样品制备方法，以“石墨烯三明治技术用以生物冷冻电镜结构解析”（ Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis ）为题发表在 PNAS 2024 , 121(5) , e2309384121 期刊上。该研究通过两层石墨烯对生物样品溶液进行封装，制备冰层厚度适宜的石墨烯“三明治”样品用于高分辨冷冻电镜重构。生物大分子被封装在两层石墨烯薄膜之间，从而彻底避免了气液界面的影响。并且由于石墨烯优异的机械强度和导电性能，该方法还可以有效抑制冰层形变，降低电镜成像过程中的颗粒漂移和冷冻样品在透射电镜下的电荷积累效应，从而进一步提高冷冻电镜照片的质量。该工作被 Nature Meth ods 作为亮点进行报道 (Graphene sandwich for cryo-EM) 。

图2“石墨烯三明治结构”冷冻电镜样品制备示意图(PNAS2024,121, e2309384121)

图4  GSAMs复合膜显著提高冷冻电镜成像质量，成功解析多种蛋白的高分辨三维结构