如何制备透射电镜（80-120kV）生物样品？

与干燥和浓缩的材料样品不同，大多数生物样品都是含水的或水合的，含有大量的水分。它们质地柔软，由 H 、 C 、 N 、 O 、 S 和 P 等轻元素组成，且不具有导电性。因此，生物样品的制备需要多个步骤才能获得 TEM 样品。生物样品通常包括 颗粒样品以及细胞和组织样品 。

1 颗粒样品

如果样品是含有颗粒或纤维的液体溶液，可以在室温下通过负染色法制备，或在低温下通过快速冷冻法制备。

负染色过程如图 1 所示。通常情况下，未经染色的颗粒在 TEM 中呈现为暗色图像，这是因为颗粒散射和吸收入射电子（散射吸收对比度）。然而，含水样品不能直接放入 TEM 进行成像。负染色需要使用含重金属的化学物质来覆盖或部分覆盖颗粒，具体取决于样品、支撑膜和染料的性质。在任何情况下，当样品干燥后进行成像时，在 TEM 投影中，颗粒样品区域呈现较亮的对比度，因为其周围区域含有较厚的染料。因此，与常规图像相比，这种颗粒呈现相反的对比度。

负染色可以通过以下方法进行：

1. 准备染色液。

2. 对带有支撑膜的 TEM 载网 进行辉光放电，以增加其亲水性。

3. 使用一对自闭式镊子夹住 载网 ，在 载网 上放置 1-3μL 样品溶液。用滤纸吸去多余的样品液体。

4. 约 10 秒后，缓慢移液 20μL 染料（醋酸铀、磷钨酸、硅钨酸钠）。在向 载网 上移液时，用滤纸条轻轻吸取对面的染料。吸去 载网 上的多余液体。

5. 将 载网 在空气中干燥。

也可以在石蜡膜表面放置一滴（约 100mL ）染色液，在上述步骤 4 中，将 TEM 载网 翻转并使其漂浮在染色液的表面上 20 秒，然后取出并在空气中干燥。

另一种负染色方法是将样品 溶液和染料按 1:1 比例混合 ，然后将混合溶液施加到 载网 上。

样品也可以进行正染色，使染料与样品形成复合物，这样颗粒在 TEM 中呈现暗色对比度。这样，正染色会增加样品的电子不透明度，使样品呈现更暗的颜色，而负染色的样品相对于周围的染料仍然保持较高的电子透明度。负染色在实验室实践中已经成为常规使用的方法。

图 1 (g) 显示了使用 2 wt.% 醋酸铀水溶液进行负染色制备的水凝胶形成肽的 TEM 图像。纳米纤维相对于周围区域呈现较亮的对比度。作为对比，图 1 (h) 显示了通过快速冷冻制备并在低温下成像的纳米纤维。这些纤维被包埋在冰中，没有使用其他化学物质，因此呈现较暗的对比度。

2 细胞和组织样品

生物细胞和组织样品含有大量的水分。为了在高真空 TEM 中观察样品，样品固定是最重要和最关键的步骤之一。通过适当的固定，细胞或组织的超微结构可以尽可能地保持接近活体样品的状态。样品可以在室温下通过化学固定进行经典制备，或在低温下通过冷冻固定进行冷冻制备。制备 TEM 样品需要多个步骤，如图 2