在治疗性抗体生产这场大戏中，一次性深层过滤器可是个重要角色。它能降低浊度，去除工艺相关杂质，比如宿主细胞蛋白（HCP）和 DNA ，这些杂质可都是关键质量属性。本研究发现，深层过滤器居然能再生，而且至少能重复使用 10 次，同时还能保持相当高的澄清能力。研究评估了三种过滤器类型，包括标准纤维素和完全合成基质材料，采用酸性或碱性溶液交替进行上样和再生操作。碱性和酸性溶液都挺有效，不过，从整体来看，过滤材料的酸性再生似乎更适合多次使用。这在含二氧化硅的 XOSP 过滤器上表现得尤为明显，HCP 和 DNA 几乎被 “赶尽杀绝”，而且在 10 次使用中都维持在较低水平。同时，产品质量也得以保持，这说明过滤器基质对再生有很强的抵抗力。这些意外发现，为下游工艺中过滤器载量提供了更大灵活性，比起一次性应用，还有生态优势。说到过滤工艺的碳足迹，计算表明能实现 4 倍的潜在节省，主要是因为塑料废物减少了。所以，深层过滤器的重复使用对生产过程中的可持续性很有帮助，还能减少二氧化碳排放。
简介
基于细胞培养的生物制药，比如单克隆抗体（mAb）的生产，那可得经过大量纯化程序，才能有满意的产量和纯度。而且现在高细胞密度和 mAb 滴度带来的挑战越来越大，这就意味着工艺相关杂质含量很高。在各种澄清技术里，深层过滤方法可能出现在下游纯化工艺的好几个步骤中。通常离心之后，它就会在初级（一级）澄清中闪亮登场，主要任务是从细胞培养收获物里去除细胞碎片和不溶性物质，从而保护后续的层析柱或除菌过滤器，不让它们堵塞，维持填料的高性能和长寿命。在更下游的地方，比如 mAb 捕获之后，深层过滤可以用于二级澄清和降低浊度，像在低 pH 调节和洗脱液中和可能产生沉淀的情况下就派上用场了。此外，深层过滤还能在病毒灭活、离子交换层析、除病毒过滤和超滤之前或之后灵活使用，延长精纯步骤中基质和层析柱的寿命。
深层过滤器除了有这些优点，还能清除相当多的杂质，尤其是工艺相关成分，比如 HCP 和 DNA，甚至有报道说它还能去除产品相关杂质，像高分子量和低分子量形式。尽早降低杂质含量，通常能让后续层析步骤更顺利。
一般来说，深层过滤器利用多层材料基质构建密度和孔径梯度。除了尺寸排阻，颗粒和杂质的截留还涉及通过疏水、离子和其他相互作用，比如氢键进行吸附。不同的过滤材料对应不同类型的深层过滤器。通常，多孔基质由纤维素纤维组成，还会加上助滤剂来增加表面积，用粘合剂稳定。比如说，带负电荷的硅藻土（DE）作为助滤剂，就特别适合结合带正电荷和疏水性的蛋白质。不过，天然来源的成分性能可能会有变化，还可能是有机和离子可提取物的来源。相比之下，最近推出的全合成过滤介质，过滤器规格更明确，被认为能提供更高的过滤器成分和功能特性一致性，和标准过滤器比起来，它在去除 HCP 和聚合物杂质方面表现更好。和 DE 一样，这种基质中用作助滤剂的二氧化硅，适合通过静电和疏水相互作用吸附带正电荷的 HCP。
深层过滤器一般都是一次性使用，是典型一次性技术的代表。一次性过滤器除了有稳定的清除特性，还能连续处理，很适合连续生产系统，因为这样可以避免系统停机进行在线清洗。不过，和多次使用比起来，一次性应用的浪费和成本通常会增加。除了要降低总体成本，生态节约资源也很迫切。
深层过滤器在使用过程中的污染机制，可能包括孔隙堵塞、滤饼形成和孔隙收缩。所以，得有有效的再生方法，去除过滤出的杂质，恢复和未使用过滤器一样有效的基质条件和清除特性。用氢氧化钠进行碱性再生，因为有杀菌和灭菌特性，已经成了清洁和消毒层析柱的标准方法。不过，用蛋白质配基或基于二氧化硅以及玻璃的层析介质，可能对氢氧化钠敏感。比如说，氢氧化钠处理会诱导二氧化硅基质中硅氧烷键水解。对碱性溶液敏感的材料，可以选择酸性处理，这是另一种大家熟知的再生基质和填料的方法。
本研究调查了在二级澄清中用作一次性耗材的深层过滤器，通过再生，其清洁和截留性能能不能恢复到可以多次使用的水平。为此，进行了好几个实验系列，包含多个过滤器使用和再生循环，评估了不同过滤器类型在碱性和酸性再生溶液中的表现。让人惊讶的是，这两种再生方法都能在多个循环中有效恢复 HCP 和 DNA 去除能力，还不影响单体产品质量。总体而言，尤其是酸性再生展现出的高截留清除能力，表明深层过滤器至少能重复使用 10 次，性能和一次性使用差不多。基于这些意外结果，我们估算了相应的生态节约潜力。详细实验操作和结果，请看原文。
深层过滤器
孵育和再生溶液
实验设计
过滤实验用 Äkta Avant 150 层析系统（Cytiva）进行，过滤器安装在柱阀上。监测压力、pH 值、电导率、OD280 ，通过样品泵调节施加量。过滤器操作压差不能超过 2.8 的极限。
使用前，用水和平衡缓冲液（各 100 L/m² ，流速 10.0 mL/min）调节过滤器。上样时，进料流量在 200 L/m²/h 范围内（XOSP：200 L/m²/h、PDD1：191 - 200 L/m²/h、VR02：184 L/m²/h），质量吞吐量约为 600 g/m² (599 - 690 g/m²)。体积吞吐量始终调整为计算出的上样流量 7.67 mL/min。收集 OD280 值超过 0.5 AU 的过滤器流出物。上样完成后，用平衡缓冲液冲洗过滤器，洗出剩余蛋白质溶液，并收集 70 L/m² 的流穿物。
用水和平衡缓冲液调节过滤器，准备下次过滤。这是参考实验的过滤器再生程序，在碱性和酸性溶液再生之前进行。
如果进行碱性处理，过滤器在初始调节后，用 70 L/m² 1 M 氢氧化钠（流速为 7.67 mL/min）预孵育，然后在使用前孵育 4 小时。用 1 M 氢氧化钠冲洗蛋白质约 30 分钟后进行过滤器再生。用水（100 L/m²）去除再生溶液。总的来说，过滤器在 pH 值高于 10 的环境中暴露约 50 分钟。为了准备过滤器用于下一次过滤，像上面说的那样用平衡缓冲液调节。
滤膜的酸性再生在蛋白质冲洗后进行，用 500 mM 磷酸或较温和的 167 mM 乙酸溶液 / 300 mM 磷酸溶液（流速为 7.67 mL/min）处理约 30 分钟。用水（100 L/m²）去除再生溶液。总的来说，滤膜在 pH 值低于 2 的环境中暴露约 50 分钟。为了准备滤膜用于下一次过滤，用平衡缓冲液调节，和上面说的一样。交替进行产品过滤和再生的过程，重复了多达 9 个循环，这样过滤器就能使用 10 次（参见图 1 中过滤器再生过程的概述（大规模实验）和支持信息：图 S1（小规模实验）。总之，过滤器上施加的蛋白质量高达约 6000 g/m²（10 × 600 g/m²）。获得的过滤池在分析前一直保存在−80°C 下。
图 1：实验装置概览，比较了 10 个深层过滤单元的单次使用和 10 次使用单个过滤单元的情况。计算了 2000 L 过滤规模 (2k) 的材料和溶液消耗量，相当于从 Protein A (ProtA) 洗脱液中获得约 3300 g 蛋白质。
结果与讨论
碱再生与酸再生的比较
在一系列实验中，用碱性（1 M 氢氧化钠）和酸性（0.5 M 磷酸）再生溶液，评估了恢复用于亲和捕获获得的 mAb 洗脱液二级澄清的过滤器的清除能力的可能性。和用于洗涤和平衡的缓冲溶液（150 mM 乙酸 /tris，pH 5.5）对比，研究了这些再生溶液对过滤器性能的影响。根据 GMP 关于封闭系统中的灭菌和内毒素灭活的指导原则，还用氢氧化钠进行初始过滤器预孵育。在每个系列中，通过交替进行蛋白质上样、过滤和过滤器再生循环，检查了过滤器总共 10 次的使用情况。每次使用时，测量过滤器在清除 HCP 和 DNA 杂质方面的性能，通过主峰分析评估过滤后的 mAb 产品质量。
纤维素纤维基质过滤器
PDD1 过滤器是含有 DE 和珍珠岩作为助滤剂的标准纤维素过滤器的代表。一开始上样中的 HCP 和 DNA 水平很高，这个过滤器在第一次使用时，几乎把所有杂质都 “扫地出门” 了（图 2A、B）。第二次使用过滤器（包括一个再生循环）后，在缓冲液参考和酸性再生的流穿中，检测到 HCP 水平略有上升，值低于 5%，而碱性程序的 HCP 含量保持在较低水平（图 2A）。第三次使用后，缓冲液对照显示出明显增加（21%），在后续使用中继续上升，最终达到一个平台期，值在上样的 50% 范围内。相比之下，通过连续酸再生获得的 HCP 水平，只是稍微增加了一点，最终达到上样值的 6.5%。不过，碱再生的水平在 7 次过滤器使用后才保持在 2% 以下，然后持续上升到上样值的 22%。
图 2：纤维素深层过滤器 PDD1 重复使用的碱性和酸性再生比较（蓝色，平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；黄色，碱性溶液 1 M 氢氧化钠；灰色，酸性溶液 500 mM 磷酸）显示（A）HCP 去除、（B）DNA 去除和（C）SE - HPLC 主峰分析产品质量。L，上样。如果缺少柱状图，则测量值低于检测限或太小而无法可视化。HCP，宿主细胞蛋白；SE - HPLC，尺寸排阻高效液相色谱法。
至于 DNA 含量，缓冲液处理后，在使用 3 次过滤器后，DNA 含量开始明显增加，使用 4 次后达到起始水平的约 40%（图 2B）。相比之下，用酸再生时，整个系列中 DNA 水平都检测不到，而碱再生在使用 7 次后，DNA 水平略有上升，最终在使用 10 次时达到 23% 的水平。在碱性和酸性再生过程中，主峰单体的产品质量保持良好，值≥98%，而缓冲液对照值下降到 96% 的范围（图 2C）。
总体而言，这些意外结果表明，PDD1 过滤器在再生和多次使用过程中，保持了高清除能力。碱性和酸性再生在多次循环中都保持了令人满意的 HCP 和 DNA 去除效果。虽然酸性处理能完全去除 DNA，HCP 值只是略有上升但很稳定，最多使用 10 次；碱性处理能在最多使用 7 次时，几乎完全去除 HCP 和 DNA，然后导致两种杂质略有增加，这表明清除能力仍然很高，但随着进一步使用，清除能力缓慢下降。不过，直到最后一次循环获得的优异单体质量表明过滤器性能未受影响。所以，循环实验表明，过滤器再生能有效去除 HCP 和 DNA，效果很惊人。在酸性处理的情况下，过滤器最多使用 10 次没问题，在碱性再生的情况下，至少 6 次过滤器使用似乎是可行的。
合成纤维基质过滤器
在相同实验条件下，用由聚丙烯酸纤维和二氧化硅组成的 XOSP 过滤器，研究了第二种过滤器类型的再生效果。关于 HCP 去除，酸性再生非常有效，能把 HCP 水平保持在最低值，最多可使用 10 次，这表明甚至还能进一步重复使用（图 3A）。本研究观察到 HCP 几乎完全去除至 100 ppm 以下的水平（见图 3D），证实了最近报道的 XOSP 过滤器与标准过滤器相比，对 HCP 和聚合物杂质去除效果更好。相比之下，碱性再生和对照缓冲液处理实现了整体减少，但没达到酸性再生的水平，然后随着循环进行，HCP 持续增加。有意思的是，过滤器的碱性预处理似乎影响了 HCP 的截留，表现为第 1 次使用后值升高，并在接下来的两个循环中进一步增加。
图 3：合成深层过滤器 XOSP 重复使用时的碱性和酸性再生比较（蓝色，平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；黄色，碱性溶液 1 M 氢氧化钠；灰色，酸性溶液 500 mM 磷酸）显示 (A) HCP 去除、(B) DNA 去除和 (C) SE - HPLC 主峰分析产品质量。(D) 显示使用 500 mM 磷酸（灰色）或 167 mM 乙酸、300 mM 磷酸（绿色）进行酸性过滤器再生的 HCP 去除。L，上样。如果缺少柱状图，则测量值低于检测限或太小而无法可视化。HCP，宿主细胞蛋白；SE - HPLC，尺寸排阻高效液相色谱法。
对于 DNA 清除率，酸性再生再次提供了几乎检测不到的值，直至 10 次过滤器使用，而从第 2 次过滤器使用开始，碱性处理观察到少量且恒定的残留 DNA 水平（图 3B）。这种现象表明在酸性处理过程中，该过滤基质的全部 DNA 结合能力得以保留，而碱性再生导致 DNA 结合能力部分丧失，大概是通过第 1 次再生循环后生效的化学改性。令人惊讶的是，即使是缓冲液对照，在 5 次重复使用前也能观察到有效的 DNA 截留，这表明这种过滤器类型有很强的 DNA 去除能力。同样，在所有酸性和碱性再生测试的重复使用中，产品质量都保持在高水平，而使用缓冲液对照时产品质量下降（图 3C）。
所以，对于合成 XOSP 过滤器，获得的结果明显支持酸性再生，以在过滤器重复使用期间保持有效的清除能力。相反，HCP 和 DNA 的去除似乎受到碱性处理的一些影响，这表明氢氧化钠与这种合成过滤基质的相容性较差。除了各自结合位点可能发生变化外，这也可能与报道的二氧化硅对碱性处理的敏感性有关，但在本研究范围内没有进一步研究。在这方面，有趣的是，增加 pH 值已被证明可以增加从 XOSP 过滤基质中提取硅的量。
综合起来，这项比较研究表明，两种类型的过滤器都能有效再生并多次使用。磷酸展现出的出色清除能力，显然更建议对合成 XOSP 过滤器进行酸性再生，而纤维素基 PDD1 过滤器在酸性和碱性再生方面都有令人满意的表现。不过，碱性处理的过滤器重复使用次数似乎比酸性再生的次数更有限，酸性再生似乎对两种过滤器都能实现 10 次以上的重复使用。酸性再生的整体优越结果，促使人们评估第 2 种再生溶液，这种溶液更温和，在实验室实践中更常见。图 3D 显示了 500 mM 磷酸与 167 mM 乙酸、300 mM 磷酸在多次过滤器重复使用过程中对 HCP 的清除率的比较，结果相似，表明再生效果相同。因此，在进一步的再生实验中选择了较温和的酸性溶液。
