在过去十年里,外泌体的分离技术得到了明显的进步和发展,在破译外泌体之谜的领域,我们取得了令人鼓舞的成果。然而,由于生物样本的复杂性,外泌体与其他细胞外囊泡在物化和生化性质之间较大的相似性,还有外泌体本身的异质性,使得如何快速并高效地分离外泌体仍然是一个具有挑战性的课题。例如,虽然超速离心法目前被认为是外泌体分离的金标准,然而这种方法需要较大的工作量,而且经此方法分离出来的外泌体中常会含有蛋白质和脂蛋白。然而,将两种基于不同原理的方法结合起来,也是一种不错的方法,但是必须要考虑额外的工作量和成本。
表一. 外泌体分离方法的比较
即使是一种热门的外泌体分离方法,超速离心法也并不是没有缺陷的。例如,超速离心法可能发生囊泡堵塞,导致膜的寿命减短,分离效率较低。外泌体膜之间也会发生互相黏附,使下游的分析受阻,引起低分离产量,有时也会出现错误的检测结果。此外,基于体积大小分离外泌体的方法还有一个需要解决的干扰,那就是与外泌体大小相似的大量非外泌体的纳米囊泡的存在。体积排阻色谱法(SEC,size exclusion chromatography)是通过重力流原理实施的,囊泡结构和完整性得到极大保留,外泌体的生物活性也被较好保存。另外,SEC有优异的重现性。然而,SEC需要较长时间的运行,这限制了它的扩展应用。
免疫亲和性捕捉可用来选择性地分离某特定来源甚至精细至某亚型的外泌体。但是,它是一个比较新的领域,最佳的“外泌体标签”还需要进一步研究。由于只有能表达被抗体识别的蛋白的一个外泌体亚群能被捕捉到,这种方法的产量较低,但是纯度相对更高。此外,由于肿瘤的异质性,对抗原表达和抗原修饰的低估或假阴性的情况也可能发生。而且,外泌体的抗体表位可能被阻断或者遮蔽。
虽然外泌体沉淀的方法很直接,而且外泌体的分离可以一步完成,但是繁琐的样品准备和清除过程,还有适当的选择性分离机制的缺乏,都不可避免地影响了分离外泌体的纯度,因此影响了后续研究。例如,外泌体与其他细胞成分的共沉淀,特别是与其他细胞外囊泡、蛋白聚合物或者一些高丰度蛋白质的共沉淀,在一些体液,如血浆和血清中都有发现。而且,不同的样本黏性和基质需要不同的外泌体沉淀严格标准,所以影响了沉淀方法的标准化。
虽然取得了不小的进步,但是,由于可扩展性、有效性和标准化等因素的限制,第一代微流体技术中没有一种方法能进入临床试验。另外,一些方法需要耗时的样本预处理,而有些应用原始样本的方法却只有很低的分离效率。目前为止,所以的微流体技术都是利用单一的一种分离机制,所以导致低产量或低特异性。而且,它们的低处理能力导致分离的外泌体中蛋白质和核酸量不足,可能阻碍下游的分析。
现有的外泌体分离技术,虽然在过去十年取得了很大的进步,但也给此领域的研究者一系列新的挑战。
参考文献:Progressin Exosome Isolation Techniques.Theranostics2017, Vol. 7, Issue 3