导读：类风湿性关节炎（ Rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，中性粒细胞胞外诱捕陷阱（Neutrophil extracellular traps, NETs）在RA的发病中至关重要。桂枝芍药知母汤（GSZD）是一种常见的止咳类中药汤剂，且在RA治疗方面表现出良好的疗效。然而，其潜在的分子机制尚不清楚。研究者通过16S rDNA扩增子测序结合生物信息学分析，发现GSZD可改变小鼠肠道微生物群组成，通过Cav-1-Nrf2信号轴减少NETs，最终缓解RA的发生与发展。该研究为RA的预防和治疗提供了全新的视角，且拓宽了GSZD的临床应用范围，是一项饶有价值的研究成果。
今天与大家分享一篇发表在中药学顶刊Phytomedicine（IF=6.7，中科院一区、JCR Q1）的文献，其中运用到了16S rDNA扩增子测序结合生物信息学分析等方法，发现桂枝芍药知母汤（Guizhi-Shaoyao-Zhimu Decoction, GSZD）可减少中性粒细胞胞外诱捕陷阱（Neutrophil extracellular traps, NETs），最终缓解类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）。
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整体研究框架（文章的图形摘要）
中性粒细胞是机体对炎症反应响应最快的免疫细胞类型之一，能够强有力地发挥细胞毒性清除感染，其中“中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil extracellular traps, NETs）”也属于中性粒细胞“武器库”的一部分。2004年Brinkmann, V等研究者通过透射电镜发现了这类细胞外的纤维样结构，其由弹性蛋白酶和染色质交联形成网状结构，能够有效地捕获病原体并将其消化。同时，NETs也在RA等自身免疫性疾病的发生与发展中发挥作用。
而当前有较多研究报道发现，中药（尤其是一些口服的汤剂）中的化合物可与宿主的肠道微生物发生相互作用，影响一些疾病进展。例如，肠道微生物群可以分泌外膜囊泡易位到关节中，直接与滑膜免疫细胞相互作用并影响RA。该研究正是以中药汤剂GSZD通过作用于肠道菌改善RA来切入分子机制研究的，下面让我们来学习一下。
2、GSZD可减少NET的产生并缓解RA小鼠的疾病进展研究者通过给DBA/1J小鼠皮内注射II型胶原和弗氏佐剂建立RA模型，并在建模之后口服给予GSZD汤剂，并设置甲氨蝶呤组作为阳性对照。研究者首先注意到不同剂量的GSZD和甲氨蝶呤均能显著缓解RA小鼠的疾病进展，主要表现为关节炎评分降低、促炎免疫细胞浸润减少和骨侵蚀缓解。
进一步，研究者假设GSZD可抑制RA小鼠的NET形成，通过ELISA检测发现口服GSZD可显著降低小鼠血清MPO和NE的水平（二者均是NET相关蛋白），这点通过免疫荧光染色、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot也得到证实。
那么，GSZD是如何影响NET水平、缓解RA小鼠疾病进展的呢？此处研究者想到了我们上面所提到的肠道微生物。
图2: GSZD通过减少NET形成缓解RA小鼠疾病进展
3、GSZD通过改善肠道菌群（尤其是Parabacteroides）减少NET相信大家曾听过一句调侃，叫“遇事不决，量子力学”。近十年以来，在生物医学领域，这句话变为了“遇事不决，肠道菌群”，即肠道微生物及其代谢产生的各类小分子代谢物等，能以非常复杂且普遍的方式与宿主发生互作，进而影响宿主各类疾病的发生与发展。而16S rDNA扩增子测序技术则是分析肠道菌群的有力工具。
16S rDNA扩增子测序是对包括肠道微生物在内的各类细菌进行种属鉴定的常用测序方法，可反映微生物的种属信息。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA对应的DNA序列，长度在1.5 kb左右，包含9个可变区和10个保守区，其中可变区可指征微生物的物种差异，而保守区则指征了物种间的亲缘关系。在对测序结果的分析中，研究者会人为地给某个分类单元设置统一的标志，即OTU (operational taxonomic units)，其相似性的阈值通常设定在97%，而一个OTU即可视作一个微生物的物种，即相似度大于97%的微生物集合。因此，对于样本中OTU数目及丰度的研究，就可以完成微生物多样性和功能分析了。
再回到这项研究中。通过16S rDNA扩增子测序，研究者发现相较于疾病模型组，口服给予GSZD后，小鼠的肠道微生物组成得到改善，且微生物多样性显著提高。值得一提的是，研究者发现疾病模型组小鼠拟杆菌（Parabacteroides）属的丰度降低，而给予GSZD后显著升高。研究者进一步通过粪菌移植实验，发现那些移植了口服GSZD小鼠肠道微生物的组别NET显著减少，至此说明了给予GSZD可以改善小鼠的肠道微环境，并进一步减少NET、缓解RA。
我们知道，Parabacteroides可分为若干属、种，那么GSZD是作用于哪一种Parabacteroides发挥作用的呢？研究者先是通过生信分析，挑出了其中组间丰度差异较大的P.goldsteinii，通过验证发现这类微生物确能降低RA小鼠的病理评分、滑膜炎症和骨侵蚀程度，同时P.goldsteinii可抑制小鼠全身或关节中NET的形成。
图3: GSZD通过调节肠道微生物群减少NET形成，并缓解小鼠RA4、P.goldsteinii通过外膜囊泡（Outer membrane vesicles, OMV）改善宿主RA我们知道，微生物影响宿主一定需要通过某些媒介，如革兰氏阴性菌可通过携带有肽聚糖等物质的OMV侵袭宿主细胞。研究者假设P.goldsteinii也可通过扩散到宿主关节中的OMV影响RA发病，他们先从P.goldsteinii中分离OMV，发现OMV给药可抑制PMA诱导活化的中性粒细胞形成NET，并降低NET相关蛋白的水平。通过对小鼠进行活体成像，研究者发现这些OMV在口服给药后6小时即扩散到小鼠全身，并在12小时后聚集于四肢。在个体层面，那些口服了OMV的小鼠RA得到显著缓解。通过这些检测，研究者进一步明确了P.goldsteinii可分泌OMV，这些OMV将聚集于小鼠关节，抑制NET形成并改善RA。
研究者进一步好奇，那这些OMV究竟是如何影响宿主RA的呢？其中涉及到哪些分子和信号途径呢？于是有了下一步研究。
图4: P.goldsteinii通过分泌OMV抑制NET形成，并最终缓解小鼠RA在分子机制研究中，研究者首先怀疑Cav-1是否在其中发挥作用。Cav-1是一种参与内吞左右的蛋白，表达于细胞膜，并广泛参与到囊泡运输。目前已知Cav-1可参与细胞氧化调节，潜在地影响NET形成。研究者发现，OMV口服给药后，小鼠Cav-1的表达显著上调，且细胞活性氧水平降低、Cav-1-Nrf2信号途径激活。研究者进一步从Cav-1缺失小鼠中分离中性粒细胞，发现OMV很可能通过Cav-1-Nrf2信号轴抑制NET形成。进一步地，研究者发现，相较于对照组小鼠，那些Cav-1缺失小鼠的RA并不能被P.goldsteinii所分泌的OMV保护，这意味着OMV是以Cav-1-Nrf2依赖的方式抑制NET形成，并缓解RA的。分子机制的验证部分并不多，相较于发表在CNS及其子刊级别杂志的文章可能稍显些单薄，但这并不影响整套研究的逻辑性与完整性，以及对中医药现代化研究的借鉴意义。
图5: P.goldsteinii分泌的OMV通过Cav-1-Nrf2信号轴减少NET形成上述研究提出了一项很有借鉴意义的分子机制，研究者进一步收集了临床数据，对RA患者和健康对照的血清、粪便和滑膜组织样本进行统计分析。他们发现，RA患者的P.goldsteinii丰度更低，且NET水平更高。同时，与对照组相比，RA患者滑膜组织中Cav-1的水平较低。通过Spearman相关性分析，研究者发现P.goldsteinii丰度和RA患者的NET水平/病理学指数呈显著的负相关，这里不再展示本部分的Figure。至此，完成了一套完整的研究。
总之，该研究的水准在中药学研究领域属于当之无愧的一流水平，从GSZD减少NET和抗RA的表型出发，筛选到关键肠道微生物P.goldsteinii，并发现了其分泌的OMV通过Cav-1-Nrf2信号途径改善RA，最终在临床样本检测中也得到了一定的验证，这为拓宽GZSD用于RA预防与治疗提供了参考。研究中所使用的16S rDNA测序技术为中药药理学及其分子机制研究提供了一个很好的切入点，值得同道们学习与借鉴。
参考文献：
Ye, H., Wang, H., Han, B., Chen, K., Wang, X., Ma, F., Cheng, L., Zheng, S., Zhao, X., Zhu, J., Li, J., & Hong, M. (2024). Guizhi Shaoyao Zhimu decoction inhibits neutrophil extracellular traps formation to relieve rheumatoid arthritis via gut microbial outer membrane vesicles. Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 136, 156254. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.156254
