今天讲的这篇文章挺有意思的，他们发现了一个影响先天免疫细胞的线粒体氧化磷酸化的基因。这篇文章是南京大学医学院附属苏州医院的博士和中科院合作，发表在27.7分的Nat Immunol上的文章：
他们首先是分析发现MDS（骨髓增生异常综合征）存在着NPM1基因的突变，而NPM1突变后会导致其表达量下降，而在MDS患者中IBD（并发炎症性肠病）也会经常出现。于是，他们就提出了两种疾病可能会由于NPM1的表达降低，存在着关联的假设（这样的假设就很有意思，通过疾病发病的相关性，提出了两种疾病的相关性，而这样的相关性又建立在某个基因的表达缺陷上，不清楚科研推理过程中科研假设的话，倒是可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》，有介绍过）。通过对IBD病理学的分析，他们发现NPM1的缺陷，的确会增加对结肠炎和结肠腺癌的易感性：
为了说明NPM1的功能的重要性，他们做了一个单倍体敲除NPM1的小鼠（全敲除的话是致命的，通过敲除单倍体，形成NPM1+/-，削弱NPM1的表达）。而这样的NPM1+/-小鼠，诱导肠炎的易感性增加。那么具体是什么细胞中的NPM1的表达缺陷，引发了肠炎的易感呢？他们首先使用Cre-LoxP系统特异性敲除了肠上皮细胞的NPM1（Cre-LoxP系统就是通过重组酶特异性敲除或敲入某个基因的技术，想了解一下的话，可以去看看《列文虎克读文献》，都介绍过），但并没有显示出对诱导性肠炎有什么差异。但他们将骨髓野生型的小鼠血液输入到NPM1+/-小鼠中后，缓解了诱导结肠炎的易感性。也就是说明造血细胞中的NPM1，可以缓解预防诱导的结肠炎：
那具体是哪种造血细胞，造成了这样的影响呢？他们发现巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞在稳态下，野生型和小鼠中比例并没多大区别。但是在DSS诱导肠炎后，NPM1+/-小鼠中，这些细胞比例都升高了。但通过分别耗尽T细胞和CD11b+ 髓系细胞，他们发现这两种细胞并不是NPM1+/-小鼠诱导结肠炎易感的原因：
另一种免疫细胞ILC3（先天免疫细胞）在NPM1+/-的情况下，DSS诱导后细胞亚群数量降低。DSS给药后，NPM1+/-小鼠中的分离的ILC3，所产生的IL22也明显减少。而通过Cre-LoxP系统特异性敲除了ILC3的NPM1后，则发现DSS诱导的肠炎变得更为严重。通过这种特异性地敲除NPM1，可以推断出造血细胞中具体是否是ILC3的NPM1缺失，造成了DSS诱导结肠炎的易感性（这就是在科研推理过程中的假设和验证的过程，也是柯霍氏法则验证的一种方法）而NPM1的缺失，造成了ILC3功能的缺失，也就是说NPM1是维持结肠先天淋巴细胞ILC3的功能所必需的：
通过对于野生型和NPM1+/-的ILC3细胞，在DSS诱导后的测序分析，他们发现在ILC3细胞中OXPHOS（氧化磷酸化）通路产生了明显的富集，而在这些差异基因中，线粒体基因表达明显受到了NPM1的调控（下图的热图，以及富集，可以看出线粒体的基因在NPM1+/-中表达明显下降）：
既然NPM1可能与线粒体相关基因以及氧化磷酸化有关，于是他们就假设NPM1的缺失，可能与ILC3中的线粒体功能至关重要。他们就进行了SeaHorse分析，确定了细胞的耗氧率（OCR，这个图在《信号通路是什么鬼？》系列中的铜死亡那几章里，也有介绍过，通过抑制剂来分析细胞的耗氧率，一般来说会和ECAR，也即是细胞外酸化率一起检测，来体现有氧和无氧呼吸），结果发现ILC3细胞中NPM1的杂合缺失，降低了响应DSS诱导后的耗氧率，说明NPM1在维持ILC3细胞线粒体的OXPHOS过程中的重要性。而使用激活剂，刺激线粒体的OXPHOS和线粒体生物发生，则能缓解DSS诱导的NPM1+/-小鼠结肠炎程度：
这也就是说明NPM1可能会通过影响线粒体基因的表达，激活OXPHOS以及线粒体发生。那么NPM1具体的功能是什么呢？他们就又对NPM1进行了免疫共沉淀分析，结果发现NPM1可以结合p65（p65大家应该很熟悉了，其实就是NFκB信号通路中，入核的部分，不熟悉NFκB信号通路的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下，这都是常见的信号通路了）。而进一步的分析也发现NPM1可以激活NFκB信号通路的传导，促进p65入核：
但光是p65入核并不足以影响线粒体DNA的转录激活，因为线粒体DNA并不会使用NFκB信号通路中的专利因子激活，线粒体中的DNA有自己独立的转录因子。于是他们假设线粒体转录因子，可能会受到NPM1和p65共同的调控（这个过程就是假设的迭代，通过实验验证得到的结果，结合之前的假设，进一步迭代，形成新的假设并进一步验证，以此推进课题，不清楚的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们分析了TFAM（线粒体转录因子A）、TFB1M（线粒体转录因子B1）和TFB2M （线粒体转录因子B2）的表达，是否会受到NFκB激活的影响，结果发现TFAM是受到p65激活的。而NPM1与p65的结合，能促进p65对于TFAM启动子的结合，也就激活了TFAM的转录：
最后他们试图将NPM1应用到临床，于是做了一个NPM1 UTR-/-的过表达，UTR-/-就是缺失了NPM1的UTR非编码区，避免转录后调控。通过这样的NPM1过表达，再通过DSS进行结肠炎诱导后发现，NPM1的过表达可防止DSS诱导的结肠炎：
最后可以用这样的示意图显示，就是ILC3细胞中NPM1结合了p65，从而激活了TAFM的转录。TAFM作为线粒体转录因子，可以通过激活线粒体基因的表达，促进OXPHOS以及线粒体生成，提高了ILC3的功能，缓解了DSS诱导的结肠炎：
这篇文章是通过提出一个假设，逐步迭代假设，一步步推进到线粒体功能，以及线粒体转录因子的激活，还是蛮有意思的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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