今天讲的这篇文章，是一篇天然产物的文章，但在机制上做得还算是不错的，但对这篇文章我还是有些疑惑的。这就是华中科技大学协和医院的主治医师发表在14.3分的Adv Sci(Weinh)上的文章，讲的是ALO（Alperine，一种天然中草药中分离的生物碱）通过与VPS4A结合抑制自噬体与溶酶体结合（自噬体与溶酶体的结合，其实就是巨自噬晚期的一个过程，通过与溶酶体结合，自噬体内的蛋白得以被消化，不清楚的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下巨自噬），抑制肿瘤的机制：
首先他们通过对NSCLC（非小细胞肺癌）细胞系进行用药，来分析ALO对于肿瘤的功能，结果发现肿瘤细胞的增殖受到了抑制。同时通过Transwell实验，以及分析EMT相关基因的表达和激活，他们发现ALO还能影响肿瘤细胞的迁移（不清楚EMT，也就是上皮间质转换的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼?》系列中EMT信号通路那几章，复习下）首先这一步骤验证了ALO对于肿瘤细胞的体外功能，也就是功能验证：
在体外验证结束后，他们就继续建立了小鼠的体内肿瘤模型，并使用ALO后，进行了体内的抗肿瘤验证。结果发现ALO在体内，也能发挥抗肿瘤功效：
那接下去，就需要深入研究ALO诱导的下游机制了。他们在使用ALO后，进行了转录组分析。结果发现ALO处理后，自噬通路和相关基因得到了富集，也就是说ALO很可能会影响肿瘤细胞的自噬。而WB验证结果发现，ALO处理的肿瘤细胞，以剂量和时间依赖性方式增加了LC3B-II和p62（SQSTM1）的表达：
LC3B-II表达增加，而p62表达下降，可以说明自噬被激活；而LC3B-II和p62的表达同时增加，说明自噬被阻滞了（这种验证结果在使用自噬抑制剂之后，经常能看到，由于p62作为结合泛素化蛋白的受体，会通过进入自噬体，并最终被溶酶体消化，所以p62的表达在自噬激活的情况下是下降的，不清楚的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列）。那么具体ALO作用在自噬抑制的过程中，是在早期，还是在晚期呢？他们通过使用早期和晚期两种不同的自噬抑制剂（敲减ATG7从而抑制早期自噬，使用BafA1抑制晚期自噬，使用Rapa来促进自噬），进行了分析，结果发现ALO的影响仅限于自噬的晚期，也就是自噬体和溶酶体结合的过程：
早期自噬抑制剂无法阻止ALO诱导的细胞死亡，那么细胞具体死亡的途径又是什么呢？他们通过使用了细胞凋亡抑制剂、铁死亡抑制剂和坏死性凋亡抑制剂分析后发现，ALO诱导的细胞死亡过程只能被凋亡抑制剂所抑制。ALO通过抑制自噬通量，会导致p62的增多，而他们查阅文献发现p62能促进ROS产生（这个过程其实就是通过文献的搜索，进行假设迭代的过程，假设的迭代在整个研究的推进中至关重要，不清楚的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们假设是由于p62的累积，导致了ROS的产生，引发了细胞凋亡：
于是他们在ALO处理后，敲减了p62后（这也就是柯霍氏法则的验证过程，通过抑制累积的p62，来分析ALO可能潜在的下游通路，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《轻松的文献导读》），发现细胞的凋亡以及凋亡相关的蛋白和ROS都得到了缓解。那么接着，关键问题就在于ALO具体是和什么样的蛋白产生了作用，导致了对自噬的影响。他们通过药物亲和的靶点分析，找出了能与ALO结合的蛋白，确认了ALO能与VPS4A相结合并且明确了VPS4A与ALO结合的氨基酸位点：
通过对VPS4A上ALO结合位点的突变，来分析ALO处理后，下游的自噬表型以及p62的累积（这一步验证其实非常难得，这样的突变验证，可以更有效地避免验证过程中肯定后件的逻辑谬误，使得验证的步骤更严谨，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
VPS4是ESCRT的亚基，ESCRT参与了自噬相关的多个膜结合相关过程。ESCRT的抑制，也会增加癌细胞对细胞毒性淋巴细胞的易感性。于是他们使用了NK细胞和H1299肺癌细胞共培养的过程中，加入ALO，结果发现ALO能提有效提高NK细胞对于肿瘤的杀伤作用。同时他们又尝试使用了YM101（这是一种双特异性抗体，可阻断 TGF-β 和小鼠 PD-L1），ALO也能提高YM101的抗肿瘤活性：
最后就形成了这样的示意图，ALO通过结合ESCRT的亚基VPS4A，从而阻止自噬体和溶酶体的结合，导致p62表达累积。引发了ROS产生，导致了细胞凋亡：
这篇文章验证过程是没有什么大毛病的，甚至可以说，在天然产物化合物的研究中，这样的验证过程也算是比较优秀的。但是有这么一个问题，就是p62累积导致ROS的产生，这个部分是引用的一篇文献Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species（PMID:27646922），这篇文章里其实并没有提到SQSTM1或者p62。（其实如果大家还记得铁死亡调控的话，应该知道p62是可以通过竞争性结合Keap1，激活Nrf2的，Nrf2作为转录因子，可以激活下游清除ROS基因的表达，不记得的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的铁死亡调控）。换句话说p62表达增多，其实是抑制ROS的。如果说p62累积抑制了ROS，可能是从自噬的角度，如果自噬被阻遏，导致了p62累积从而无法清除细胞中产生的ROS。那么这样的话，在使用ALO后，敲除p62其实意义就不大了，可能会造成其他的影响也说不定。这就是我还没能理解的地方，但是整篇文章论证并没有什么别的毛病好，大家也可以在评论区积极讨论哈。
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