► 复旦大学生物医学院于文强教授实验室
撰文 | 于文强（复旦大学生物医学研究院教授）
责编 | 叶水送
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科学研究中颠覆性发现从来都是充满艰辛和曲折，尤其是挑战人们已形成的共识。科学史上这样的例子比比皆是，光的波粒二相性就是最典型的例子。光的波动说与微粒说之争从十七世纪初笛卡儿提出的两点假说开始，至二十世纪初以光的波粒二相性告终，前后共经历了三百多年的时间。免疫系统中的体液免疫学说和细胞免疫学说的争论也是科学史上最著名的争论之一，直到1903年Wright和Douglas把二者统一起来。
没有争论，哪来进步？
肿瘤的表观遗传学领域也有一场争论。1983年，Andrew Feinberg 发现肿瘤细胞中存在全基因组的DNA低甲基化现象，但不能解释其发生原因，1985年，Stephen Baylin发现肿瘤抑制基因的启动子高甲基化导致了肿瘤抑制基因的沉默，一时间肿瘤的高甲基化研究成为热点，低甲基化研究则陷于低谷。直到1998年，Andrew Feinberg发现肿瘤细胞的全基因组DNA低甲基化导致肿瘤的基因组DNA不稳定，从而诠释了肿瘤DNA低甲基化与肿瘤发生的内在联系，这时人们才认识到肿瘤的全基因组DNA低甲基化和局部高甲基化共同参与了肿瘤的发生。
“颠覆性发现”带来的囧境
最近5年，我们实验室发现了miRNA激活机制，尽管我们为这个“颠覆性”发现激动不已，但是后来的曲折经历告诉我们，这简直就是一个“坑”。因为在既有理论中，miRNA抑制理论占有绝对优势地位，而其激活研究则显得形单影只，难以获得人们支持。
表观遗传学作为2000年后逐渐兴起的新学科，国内外的竞争非常激烈。2010年初，我作为PI回到上海复旦大学工作后不久，实验室刚刚起步，学生是从国内的本科刚刚毕业，实验技术基础比较薄弱，即使我追着表观遗传学的前沿问题去做，也可能总会比别人慢半拍。一方面我着手实验室的平台建设，力图开发我们自己独有的实验技术方法，形成人无我有，即使我们慢一些，别人也很难超越我们；另一方面，围绕表观遗传学领域的重要问题，独辟蹊径，做我们自己的方向。通过5年持续性的工作，我们发现miRNA不仅有抑制基因表达的作用，同时还可系统性地激活基因表达，但这一颠覆性发现不仅没能给我带来同行认可，反而让我的文章发表四处碰壁，投稿过程充满艰辛。我们从顶尖杂志投起，先后被拒绝数次，直到最后被RNA Biology杂志接收。
►miRNA激活基因表达研究，刊发在影响因子只有5分的RNA Biology杂志上
有意思的是，我们去年投稿的时候RNA Biology 的影响因子还大于5，学生能够勉强毕业，今年RNA biology（IF=4.97）的影响因子小于5了，复旦大学的研究成果一般统计大于5分的文章，所以我们所做的研究就被忽略不计了，这5年多的时间work for nothing！一声叹息！
►诺奖得主Phillip Sharp近日在Cell上发表一篇与我们结论类似的研究
尽管我们认为，科学研究中颠覆性创新从来都不会一帆风顺，尤其是挑战人们已形成的共识，更是一波三折，不过有时候对诺奖得主来说，就不会出现这样的波折。2017年3月9日，因基因剪切研究而获得1993年诺贝尔生理或医学奖的麻省理工学院教授Phillip Sharp在Cell杂志发文称，通过生物信息学分析发现增强子与miRNA的表达密切相关，而超级增强子介导的miRNA表达与组织特异性的形成有关。仔细研读后发现，这篇Cell刊发的文章最主要的结论和新意就是增强子活性与miRNA 的表达具有超强的相关性，他们的结果和分析不仅验证了我们的已发表的研究发现，并进一步支持我们提出的miRNA激活理论。看完这篇文章，我感到欣慰，终于有一个国际大牛的结果印证了我们已有的发现，同时我也高兴不起来，他的发现可以发在Cell杂志，而我们的研究就那么不被编辑们看好。有意思的是，这篇Cell文章并没有引用我们的文章，权当是无意的忽视吧。
“颠覆性”发现带来的酸甜苦辣
1993年，第一个miRNA lin-4在线虫中被发现。20年来，miRNA被认为主要通过作用于基因的3 UTR发挥下调基因的作用。但是作为非常保守并具有组织特异性表达的miRNA的研究远不至此：
1）miRNA的功能至多是一个“马后炮”的作用，总是对已存在的基因发挥下调作用，miRNA能否在在转录水平直接发挥调控作用是一个重要的科学问题；
2）miRNA研究中的选择性无视（Selected Neglect）现象。当miRNA高表达时，总是伴随着许多基因的上调和下调。人们习惯上只在下调的基因中寻找靶基因，而对上调的基因视而不见。而你如果要将miRNA与上调基因联系起来讲故事，就必须找出一个Repressor，但在多数情况下，很难找到一个合适的Repressor。miRNA能否直接参与基因的激活值得我们关注。
3）细胞核内miRNA的功能性研究缺失。许多证据表明miRNA可以定位于细胞核中，但细胞核内的miRNA如何在核内发挥调控作用远未被人们所认知。要解决这些问题，miRNA研究必须换个思路，找条新路。
当时miRNA的研究如火如荼，其中miRNA与肿瘤发生发展和转移的相关研究尤为热门，许多文章发表在顶尖杂志上。我们既也没有赶潮流本钱，也不想赶这个潮流。由于越来越多研究发现miRNA上下两条链均可以作为独立的miRNA发挥作用，我们当时问了一个很简单的问题，miRNA的上下两条链作用是相反，相同还是协同，有没有其他调控方式。
当我们研究miRNA基因座位周围的表观遗传学特征时，我们惊讶地发现当时总共700多条miRNA中的大约400多条miRNA的基因座位与增强子的组蛋白标记物H3K27ac或H3K4me1高度重合，换一句话说miRNA的基因座位就是潜在的增强子，进一步分析发现人类现有的1871条miRNA中有超过1263条miRNA与增强子有关。这时有文献报道发现部分miRNA确实可以直接定位于细胞核，我们据此提出假设：既然在进化上miRNA基因座位与增强子高度切合，miRNA就可能与增强子存在相互关联，并可能通过增强子发挥基因调控作用。假设容易证明难，因为当时几乎所有的miRNA研究都集中在细胞浆中通过结合3’UTR发挥基因抑制作用，而增强子的功能研究也才刚刚起步，我们能够参照的实验方法也不多。
经过一遍又一遍地探索，我们发现细胞核内miRNA可通过激活增强子进而发挥系统性的基因激活作用，并证明细胞核内miRNA激活基因表达具有普遍性的意义，也就说miRNA的功能具有两面性，当miRNA在细胞浆时，它可以通过传统的机制结合靶基因的3’UTR抑制基因的表达，而细胞核内的miRNA则通过激活增强子发挥系统性的基因激活作用。鉴于miRNA的组织特异性表达以及增强子的组织特异性激活，我们认为miRNA的一身二任直接参与到细胞的命运转换，进一步推测miRNA介导的基因激活在胚胎干细胞的分化编程以及正常细胞转变为肿瘤细胞中发挥重要的作用。
一波三折的投稿经历
miRNA的激活研究充满了曲折和艰辛，许多重要实验结果我们至少重复四次以上，其中至少有一次是由没有参与这个项目的其他实验室成员重复的。我们的文章在2013年6月份完成，几位表观遗传学领域的重量级老师对我们的文章进行评议和指导，看了我们的结果，很惊讶。
最终，我们将文章投向顶级期刊，编辑经过初步审核认为我们的研究结果非常有意思。
“The Editorial Board agree that this is an interesting new phenomenon”。
编辑需要对机制进行细致研究。此后，我们用了将近一年的时间通过TELEN技术敲除miRNA的增强子靶序列，但在重新提交时，他们认为，我们的证据不足。
Although we appreciate the potential interest in identifying a distinct nuclear role for miRNAs……, we're not seeing that the work provides sufficient support for the proposed role.
经过了漫长的20多天等待，我们收到编辑的拒稿信。但他们认为，我们的工作还是有趣的。
We find the topic interesting, and we can see how your work provides a broader view of nuclear small RNA functions in activating transcription.
编辑的回复彻底击碎了我们的梦想。我们改投到其他杂志，反馈意见一样让我们沮丧，形势犹如“老太婆过年，一年不如一年”。
折腾下来，我们补实验投稿，再补实验再投稿，文章增加到60多页，图表80多副。直到2015年4月25日，我们将研究结果投往RNA Biology杂志，前后经过三轮审稿，我们又补了许多实验，终于在2015年10月22日被RNA biology杂志接收发表。
有意思的是，在文章审稿中，审稿人坚决不同意我们对这类miRNA激活现象重新命名为NamiRNA（Nuclear Activating miRNA）。后来鉴于这类miRNA的功能与增强子有关，我们改名为CemiRNA ( Enhancer associated miRNA )，最后还是被审稿人否决。
没有命名权，哪来的话语权！
虽然我们的文章在这么低影响因子的杂志发表，但做为我们自己5年多的心血，我从来不认为我们的工作无关紧要，它就像一个蹒跚学步的孩子，我相信她一定能够长大成人，发挥非常重要的作用。
“颠覆性发现”逐渐被认可
如果以杂志的影响因子来判断一项研究成果的价值，那无疑我们的miRNA激活研究毫无意义，科研成果自然也算不上。以目前的惯例，你可能都不好意思把你的研究成果在别人面前展示。有人会说，文章发的那么低，你还好意思说，因为杂志的影响因子代表了你研究成果的重要性和意义。但我不这么认为，我先后将我们的研究成果在许多国际和国内会议和研究机构去展示，去讲解，得到了许多正面的反馈。
2013年，我在RNA冬季研讨会上第一次报告我们的miRNA激活研究，有人说这是近年来miRNA研究领域少有的激动人心的故事。大多数研究者对我们的研究结果直呼没想到，认为miRNA的抑制理论束缚研究者的思路。在2016年初的Keystone 表观遗传学会议上的墙报展示环节，许多人对我们的研究表现了很高的兴趣。在表观遗传学领域里做了许多重要的工作的日本东京大学细胞生物学家崛越正美教授（M. Horikoshi）听完我们的海报讲解，问我为什么不投CNS杂志，当我们告知文章的投稿经历后，评论道，“我在顶尖杂志发表了许多文章，但最好的文章是发在Genes Cells杂志上（IF=2.48）”。他认为，5分以下的文章大多是对过去既有理论的验证，10分左右的杂志是对当下理论的延伸性研究，而CNS杂志上的文章则是对未来1到2年研究趋势的判断和引领，所以我们的研究不被顶尖杂志看好也是正常的。
2016年11月15日，在冷泉港亚洲的RNA biology国际会议上，我在大会上报告我们的研究结果，报告结束后，被“拷问”了15个问题之多。2017年3月12到17日在美国加州举行的Gordon Research Conference（美国生命科学研究领域三大顶级国际会议之一）大会上，我再次应邀在大会报告中讲解我们的miRNA激活研究，会场气氛热烈。随着Sharp这项研究的出现，我相信会有更多人投入到miRNA激活基因的研究领域，人们也必然会重新审视miRNA的新功能。
阴阳平衡是自然界的重要规律之一，有阴就有阳，一正一反也是哲学辩证法的重要支点，miRNA做为重要的基因调控者，在细胞核内激活基因和在细胞浆内抑制基因表达应该说是阴阳平衡理论的重要应用和哲学辩证法的有力支持。然而在当前miRNA抑制理论占有绝对优势地位的情况下，miRNA的激活就显得形单影只，这种研究很难获得人们的支持。
如果我们将所有miRNA激活的机制都做清楚了再发文章，我不知道要等到猴年马月。这样做了，按目前博士研究生毕业标准，学生拿不到学位，我们的考核也过不了关。其结果是学生熬不住从实验室走光了，我也得失业了，实验室还不得关门大吉！好在我们的文章发了，学生毕业了，虽然留有遗憾，但也是不得已而为之。
在这里，我也要为复旦大学点赞！得益于复旦大学对科研人员宽松的研究环境，使我们在发了这么低影响因子文章情况下还能够继续带领我的学生们从事我们喜欢的研究工作。其实从现实和世俗的观点上讲，这样的研究除了满足了科学的好奇心外，既得不到信誉，可能也算不上重要的科研成果，更谈不上对国家、学校、学生以及纳税人有一个满意的交待。这也许是科学工作者的涅槃：科学虐我千百遍，我待科学如初恋。
参考文献：
1.Xiao M, Li J, Li W, Wang Y, Wu F, Xi Y, Zhang L, Ding C, Luo H, Li Y, Peng L, Zhao L, Peng S, Xiao Y, Dong S, Cao J, Yu W. MicroRNAs Activate Gene Transcription Epigenetically as an Enhancer Trigger. RNA Biol. 2016 Feb 6:0. doi: 10.1080/15476286.2015.1112487.
2.Suzuki HI, Young RA, Sharp PA. Super-Enhancer-Mediated RNA Processing Revealed by Integrative MicroRNA Network Analysis.Cell. 2017 Mar 9;168(6):1000-1014.e15. doi:10.1016/j.cell.2017.02.015.
制版编辑：李 赫丨
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