药明康德/报道
当新航路开辟和地理大发现的曙光照亮欧亚大陆，500年前的眼镜商铺就诞生了最早的光学显微镜和望远镜，从此人类探索未知边界的视线，便有了南辕北辙的分野。而今我们可以借助位于外太空轨道的天文望远镜，眺望百亿光年之外的硕大天体；也可以通过最尖端的冷冻电镜，透视近在咫尺却扑朔迷离的微观粒子。
▲高宁博士在他的办公室中
在两年前《Nature Methods》杂志的年终盘点中，冷冻电镜技术被誉为2015年最受关注的技术。博导高宁博士就亲自见证了冷冻电镜研究在中国的萌芽、成长与兴盛。他说数以亿计的蛋白质大分子组成了功能庞杂的秘密军团，共同构建了精巧的生命机体，而这得益于核糖体能按照mRNA信息，将氨基酸高效准确地合成蛋白质多肽链。他渴望借助比鹰眼更锐利万亿倍的冷冻电镜，从蛋白质结构与核糖体组装的高清成像中窥探生命的奥妙。
高宁博士在北大完成本科课程之后，前往美国纽约州立大学阿尔巴尼分校（University at Albany, SUNY）深造，师从美国科学院院士Joachim Frank教授，于2006年毕业并获得“杰出博士论文奖”。之后在霍华德休斯医学研究所、哥伦比亚大学等实验室进行博士后工作。2008年加入清华生命科学学院，并参与冷冻电镜实验平台的搭建，在《Nature》等世界级刊物上发表十余篇重磅论文，首次揭示多种复杂蛋白质大分子及核糖体组装因子的三维结构和机制，于2016年获得药明康德生命化学研究奖。2017年4月，高宁博士重新回到母校，协助北大建设冷冻电镜学科方向。
毫秒内冰冻成像：破译超级蛋白三维结构
药明康德：您出国留学的时候，冷冻电镜还是比较小众的科研领域，而今已成为结构生物学中最为重要的技术之一。您当初选择这个研究方向有哪些契机？在见证冷冻电镜技术发展的过程中，有哪些特别的感触？
高宁博士： 在分子生物学领域，大家最关注蛋白、核酸等生物大分子通过何种方式组合并互相作用、进而影响或实现各种细胞功能。只有了解这些大分子的三维结构，才能知道其功能的结构基础，从而从细胞和组织水平来分析宏观生物学现象。正因为如此，我通过多年的学习以及名师的指导，选定了结构生物学作为自己的研究方向。2001年我进入了纽约州立大学阿尔巴尼分校，有幸师从美国科学院院士Joachim Frank教授。他是美国科学院院士以及霍华德休斯医学研究所的研究员，更是冷冻电镜技术的创始人之一，是他将我带到了最前沿的结构生物学领域。
▲2011年4月，高宁博士与其博士导师Joachim Frank同游金山岭长城
其实结构生物学的三大技术包括X射线晶体衍射、冷冻电镜以及核磁共振；但长期以来，冷冻电镜曾经是最小众的领域，当时远远没有现在这么引人注目。2013年之前，全球从事这个研究的实验室还不超过100个。但是在2013年，电子直接探测相机等新型成像设备大大提升了冷冻电镜照片的质量，并且更为有效的结构解析算法开发获得成功；无需结晶，使分子样品在毫秒之内冷冻呈玻璃态，科学家就可以得到某些蛋白质的原子分辨率冷冻电镜结构，这无疑带来了一场结构生物学的革命，使很多X射线晶体领域的科研人员也开始利用冷冻电镜技术。
在过去三年的时间里，冷冻电镜已经成为生物大分子结构解析的主要方法。不同专业背景的研究人员加入这个技术方法开发的行列中，使得单颗粒三维重构技术日趋成熟。2016年全球各地通过该技术解析出的分子结构数目实现跳跃性增长，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动规律达到前所未有的深度和广度，几乎每个重要生物大分子及其复合物高分辨率结构的阐明，都揭示了一项基本的结构功能相关机理。
药明康德：您的团队与香港科技大学研究组在《Nature》杂志上共同发表的论文，是清华国家蛋白质基础设施建立以来，首次完全利用此平台进行数据收集发表的顶级科研论文。除此之外，您的团队也和其他国家、地区的不同领域科学家联合发表了许多优秀的学术成果，在这些合作的科研项目中，冷冻电镜技术起到了哪些关键的作用？
高宁博士：《真核生物DNA复制解旋酶MCM复合物3.8埃分辨率结构》是我的团队在清华参与发表的第一篇《Nature》论文。双链DNA的复制包括解旋和复制两个过程，MCM2-7复合物则是DNA解旋酶的核心组分。由于其结构的复杂性，针对该复合物的高分辨三维结构解析一直停滞不前，这篇论文解决了30年来的学术难题。这项研究为DNA复制异常导致的基因组突变和恶性肿瘤机制研究，提供了宝贵的基础医学数据。
▲高宁博士的团队在清华参与发表的第一篇《Nature》论文（图片来源：《Nature》）
当时的数据整理和论文撰写的兴奋与紧张依然历历在目，我们仅仅花了3周时间就将数据变成论文；不论是团队里的学生还是合作方的成员，当时工作的节奏和效率都很快，我们在投稿四周之后就得到了一审确认接受的消息。对于所有科研人员来说，第一篇在顶级学术期刊发表的论文，一定都是终生难忘的。
生命科学的范围很宽广，每个细分领域之间隔行如隔山。因为冷冻电镜三维重构已经成为观测许多大分子结构的重要手段，所以我的团队对于和相同领域甚至不同领域的各地实验室合作非常开放，这样也有利于团队中年轻学生的成长。其中比较重要的科研成果包括与其他科学家合作，在《Nature》杂志上发表的不少论文成果。《哺乳动物机械敏感Piezo1离子通道的结构》首次报道了哺乳动物Piezo1高分辨冷冻电镜结构，该蛋白家族是目前已知所有膜蛋白中跨膜区最多的蛋白，其中Piezo1蛋白作为靶标在心血管疾病和癌症治疗过程中有重要研究意义。另外《哺乳动物呼吸体结构》则首次报道迄今分辨率最高的线粒体呼吸链超级复合物——呼吸体的冷冻电镜三维结构；这是迄今人类已解析分子中最大、最复杂的膜蛋白超级复合物，为我们深入理解哺乳动物呼吸链复合物组织形式、分子机理以及呼吸疾病治疗提供了重要结构基础。
核糖体装配因子：抗击癌症、病原体的另类靶标
药明康德：核糖体作为蛋白质生物合成的场所，在细胞代谢中有举足轻重的地位。您研究的重点之一就是核糖体的组装和功能，请您谈谈对于核糖体的结构认识，以及核糖体在蛋白翻译调控方面的最新进展。
高宁博士：我们和卡内基梅隆大学John L. Woolford Jr.教授的实验室建立了长期合作关系，因为两个团队都关注核糖体组装的研究，但是重点略有不同，是非常好的互补。我们最近有个代表性的突破性进展，是在《Nature》上发表的《细胞核内核糖体组装前体结构揭示装配成熟因子功能多样性》。
▲高宁博士和John L. Woolford Jr.教授近期共同发表的《Nature》论文（图片来源：《Nature》）
核糖体是细胞内非常大的分子机器，主要功能是从mRNA翻译蛋白质，受到细胞内其他信号通路的调节。真核生物核糖体装配过程是个高度复杂的动态过程，有超过300种不同功能的辅助装配因子（蛋白质或者RNA）参与其中。然而绝大多数装配因子的结构及其行使功能的分子机理完全未知。该研究以酵母细胞为模式系统，获得细胞核内核糖体组装前体分子，通过冷冻电镜获得高分辨率三维结构，确定了超过20种不同装配因子在核糖体60S前体上的结合位置，获得了19种装配因子的原子模型。
另外，异常核糖体的分解机制也是我们研究的重点领域。核糖体翻译mRNA过程中一旦遇上翻译停顿，必须有相关机制将核糖体功能终止并回收，以维持细胞的翻译能力。我与瑞典Uppsala大学的Suparna Sanyal教授团队合作，结合作者擅长的快速动力学技术和我们的冷冻电镜，研究大肠杆菌中HflX蛋白解离细胞内在不利生长条件下积累的核糖体复合物。
同样以大肠杆菌为模式细胞，我的团队与日本弘前大学（Hirosaki University）姬野俵太（Hyouta Himeno）教授团队合作，发表了《ArfA、RF2介导的翻译终止机制》。解析了ArfA-RF2介导的non-stop mRNA翻译终止复合物的结构。通过结构解析，我们发现ArfA蛋白N端作为mRNA长度的感受器， C端则通过和RF2直接结合，从功能上补偿了终止密码子对RF2的激活效应。该研究展示了具有极大结构柔性的小蛋白，可以通过结构模拟来取代mRNA上的三碱基终止密码子的功能。
▲高宁博士和姬野俵太教授近期共同发表的《Nature》论文（图片来源：《Nature》）
药明康德：核糖体研究是否和表观遗传学、转录组学一样，都可以为癌症治疗和基因突变研究提供宝贵的线索？在对抗病原体方面又有哪些独特的转化医学前景？
高宁博士：从基因的转录到翻译，蛋白质在很大程度是执行最后功能的大分子；不管是癌症中的抑癌和促癌分子，整个过程都要通过核糖体翻译来产生并行使功能。真核细胞的翻译调控非常复杂，从细胞核内的转录起始，通过一定过程把组装前体运输到细胞质。核糖体的组装与细胞的生长调控通路密切相关，某些装配因子的遗传突变会导致核糖体生物生成的失调，并使细胞产生应激信号，导致某些癌症、遗传疾病和严重发育障碍。事实上，某些特定的核糖体组装因子不正常表达，已经在多种人类癌症细胞中被发现。因此，针对核糖体装配过程的研究不仅具有重要的科学意义，还具有潜在的临床应用潜力。
▲3D打印而成的核糖体结构
抑制病原体核糖体的研究是我们在转化医学领域的另一个重要研究方向。绝大多数抗生素都是从天然抗生素改造修饰得来，而很大比例的天然抗生素都是作用于细菌或其他病原生物的核糖体，从而发挥功能。蛋白翻译对每个细胞都至关重要，一旦核糖体的功能被抑制，则细胞生长受到限制。通过亿万年的演化，多种微生物为了竞争生存空间，演化出抗生素这类分子，分泌到胞外杀死对手。通过对蛋白质翻译和核糖体机制的了解，更有利于人类开发有效抗生素，尤其是应对超级耐药菌的新型抗生素。同时我的实验室还针对人体寄生虫的核糖体开展了一系列研究，就是希望通过对结构上的分析，寻找新的靶点，以此设计小分子抑制疟原虫、弓形虫、滴虫等多种原生寄生虫的核糖体翻译活性。
胼手胝足跨界鼎力 推动结构生物学迭代前行
药明康德：在多年的学术生涯中您发表了很多优秀的论文和科研成果，也见证了清华冷冻电镜平台的发展。在这个过程中，您最深的感触是什么？
高宁博士：在我本科毕业的时候，不少领域的整体科研水平和国外还有较大差距，所以很多同学选择到国外深造。清华是当时国内为数不多、愿意花费大量人力物力打造冷冻电镜平台的学术机构之一。
清华许多师生，特别是刚刚参加科研工作的青年老师和学生，都表现出惊人的勤奋与毅力。这些年来我很少有节假日和周末，习惯性地来到实验室已经成为工作甚至生活的常态。每天工作超过10个小时很经常，如果需要准备具有高度竞争性的论文，甚至需要通宵达旦。我想正是通过无数同仁的努力，现在我们欣慰地发现：在我专攻的领域，不论从学生培养，还是设备的使用调试以及相关研究成果来看，与国际一流水平相比已经没有太大的差别。现在中国已经有很好的实验室，学生不一定非要选择出国，国内的科研环境和成就前景也不逊于西方。而清华更是已经成为全球举足轻重的冷冻电镜中心。作为一个中国人，最让人自豪与感动的，莫过于见证一个伟大的时代，推动整个科研领域从无到有、在世界范围内跨越鸿沟。
▲高宁博士与学生毕业论文答辩后合影
北大过去没有冷冻电镜中心，作为北大校友，我今年还将和同仁们参与北大的相关平台搭建和学科建设，并且招聘年轻合格的科研人员。我觉得这是自己作为北大校友应尽的一份义务，所以今后的工作角色可能会有一些微调，但大方向和过往一脉相承，不会有大的变化。
药明康德：冷冻电镜的研究是基础科学与高精尖仪器紧密结合的研究领域，需要多种学科的跨界交流。对于未来的科研方向，您有哪些具体的展望？
高宁博士：现在有不少学者开始关注表观遗传学和转录组学，但是涉猎蛋白质翻译领域的科学家还很有限。过去有学者认为每一个单位的mRNA可以翻译成等量的蛋白质分子，但事实上mRNA在不同核糖体中的翻译过程，受到的调控并不一样。细胞有复杂多样的蛋白质翻译调控，这个领域在未来渐渐会成为新的热门领域，而冷冻电镜在该领域的研究中也一定会发挥更多的作用。
结构生物学对实验仪器硬件要求很高，全套设备的价格高昂，达到数千万，能够开展相关研究的都是实力雄厚的研究所和大学。在我读博士的时候，冷冻电镜技术的方法论发展还处于早期阶段，对学生的数学能力、计算机软件使用、电镜操作的要求都很高。现在经过十几年发展，电子显微镜和三维重构数据处理能力越来越自动化，学生只需要进行严格培训就能承担工作。
▲高宁博士在香港杜莎夫人蜡像馆
所以，计算机对于我的专业领域发展来说至关重要，广义的人工智能也是冷冻电镜技术发展中必不可少的要素。冷冻电镜单颗粒三维重构依靠的就是大数据，原理是通过电子显微镜将被研究分子进行二维成像，然后通过计算机将成千上万张甚至数百万张二维照片，重构成三维结构。庞大的数据分析包含很多机器学习的算法，以提高结构解析的精度和速率。
计算机发展非常迅猛，层出不穷、迭代迅捷的软硬件设备，在不断地推进结构生物学的外延边界。相信通过跨界精英的共同努力，一定能够在各种生物大分子研究的领域带来更多的惊喜和创新成果：比如不断提高解析分辨率、获得静态结构之外的生化反应全步骤结构信息，甚至将结构生物学与其他医学分支融合发展出新型检测手段等等。
