专栏名称: BioArt

BioArt致力于分享生命科学领域科研学术背后鲜为人知的故事，及时报道和评论生命科学领域有料的动态，BioArt也是一个生命科学领域“百花齐放，百家争鸣”的舞台，循“自由之思想”与“独立之精神”为往圣继绝学。

实用Webinar：流式大咖带你正确设置对照，避免实验白做

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-27 08:32

正文

流式细胞纵有万般好，还是有很多人被实验结果搞得焦头烂额。

要么信号弱、无阳性信号，要么背景强、非特异性信号多。

解决问题的关键在实验设计和样本制备。

接下来，我们就抛砖引玉，小小的剧透一下，讲一讲流式实验设计的对照设置技巧吧！（更多FCM实验方案将会在11月28日19:00的讲座中深入讲解，欢迎大家报名参与。）

选择适宜的对照是流式细胞术（FCM）正确获取和分析数据的基础。

对照设置作为FCM的第一步，常常让人闻风丧胆。有的同学辛苦设置半天，最后发现一个能用的对照也没有；有的压根不知道需要设置多少种对照，一堆数据砸手里；还有的同学，偷懒不设置那么多对照，结果阴阳难分，支支吾吾的跟导师解释不清。

那么究竟需要设置多少种对照呢？该怎么设置呢？

本次课程主要分享4种，分别是阴性对照、单染对照、同型对照、FMO对照。

1）阴性对照

每一种细胞都会产生非特异性荧光。FCM检测结果是细胞本身非特异性荧光与细胞表面结合的特异性荧光叠加的效果。阴性对照是为了确定与细胞自身的非特异性荧光的强弱。

阴性对照一般为空白对照，未染色的样本，可以确定阴性细胞群、细胞大小以及颗粒度，区分细胞的背景荧光和本底的自发荧光，或者排除实验处理过程中引入的荧光干扰，避免假阳性的结果。还可以辅助调节电压，看到细胞的本底信号，在圈门时直接排除。

2）单染对照

在多色流式panel实验时，不同荧光素的叠加会影响结果。单染阳性对照只对一种荧光染料的对照管染色，显示不同荧光素之间的重叠水平，进行调节补偿和电压。在实验方案中有几种不同的荧光素，就需要设置几个单染对照组。

荧光补偿调节设定好后，细胞群应位于单阳区域，即左上和右下位置的细胞群应垂直或平行于横纵坐标轴。单染样本首选细胞样本，无合适细胞样本时可用微球代替。单染样本的荧光素必须与实际样本的保持一致。

3）同型对照

同型对照是使用与检测抗体种属来源相同、免疫球蛋白亚型相同、偶联荧光素相同但不与目的抗原产生特异性反应的抗体作为阴性对照，需要使用剂量和浓度相同。

同型对照是为了排查抗体与细胞上Fc受体、抗体或荧光素与细胞成分的非特异性染色，确认染色结果的可靠性。建议同型对照抗体和检测抗体购买自同一个厂家。

4）FMO对照

荧光减一对照（FMO）也称之为圈门对照，用所有荧光抗体染色细胞，但会去掉其中一种荧光抗体。比如，用FITC、PE、APC和DAPI进行4色实验，FMO对照可以按下表进行设置：

在分析FCM数据时，设门是非常重要的。FMO通过减少一个通道的荧光信号，帮助衡量其他通道的荧光溢漏情况，目的是评估荧光染料的相互干扰和补偿本底，帮助更准确地设置圈门位置，准确区分阳性和阴性细胞群体。尤其当细胞群体无法清晰界定或比较稀少时，需要FMO来解释流式结果并准确设门。

正确设置对照仅仅是FCM的起始，要想获得低背景、高特异性的流式检测结果，还需要选择合适的抗体、制备高质量的样本等。接下来我们交给义翘神州FCM资深实验专家孙月红老师吧。

11月28日19点，我们特邀FCM资深实验专家孙月红老师，带领大家一同深入讲解流式细胞实验设计及关键参数设置技巧，结合实际案例对流式数据（或图）以及进行详细分析，汇总常见问题及优化方案。并结合流式应用抗体开发策略，助您精准定位、高效分析。

立即报名听课，让你从科研小白升级为流式大神，掌握FCM十八般武艺！

关注“义翘神州”微信公众号

回复关键词“义翘讲堂”，即可获取参会入口