文章来源于验小六的晚课时间，作者Dr. Wu
PCR（聚合酶链式反应）作为分子生物学中的一项核心技术，自其诞生以来，极大地推动了生命科学和医学诊断领域的发展。而PCR熔解曲线分析技术（Melting Curve Analysis, MCA）作为PCR技术的一个重要分支，以其独特的优势在分子诊断领域展现出广泛的应用前景。本文将深入探讨PCR熔解曲线分析技术的原理、在临床中的应用，并与实时荧光PCR（qPCR）技术进行对比分析，以期为读者提供全面的了解。
技术原理：
精准锁定，
温度揭示真相
PCR熔解曲线分析方法是一种
PCR技术衍生
的检测方法，它
整合了多重PCR、荧光PCR以及熔解曲线分析三大技术
。为了便于理解PCR熔解曲线分析技术，从PCR技术、熔解曲线分析技术原理进行分享，揭示技术真相。
PCR是一种在体外模拟DNA复制过程的技术，通过设计特定的引物，在DNA聚合酶的作用下，以目标DNA为模板，进行反复的变性、退火和延伸三个步骤，从而实现DNA片段的指数级扩增。
PCR熔解曲线分析技术是在PCR反应完成后，
通过逐渐增加温度并监测每一步的荧光信号来检测和分析扩增产物
的方法。其基本原理在于，
不同的DNA片段
由于其碱基组成和长度的差异，
具有不同的熔解温度（Tm）
。在PCR反应结束后，通过设定特定的热循环程序，对PCR产物进行逐渐加热，同时监测体系中的荧光信号变化。随着温度的升高，双链DNA逐渐解离成单链，结合在双链DNA上的核酸嵌入式染料（如SYBR Green I）因失去结合位点而重新游离在体系中，导致体系荧光信号的衰减。
当DNA双链结构解离一半时对应的温度即为该DNA片段的熔解温度（Tm）
。
目前，主要有荧光染料【原理见图2a】 / 荧光探针熔解曲线技术【原理见图2b】两大类。
图2a 图2b
目前临床应用最为广泛的是基于荧光探针熔解曲线技术方法
，该技术是一种基于荧光PCR探针技术的检测方法，它整合了多重PCR、多色荧光探针以及熔解曲线分析三大技术，该技术的基本原理是，在PCR反应体系中加入一个与靶序列特异性结合的荧光探针，该探针通常包含荧光基团和淬灭基团，在PCR扩增结束后，通过逐渐加热反应体系，监测荧光信号随温度的变化，绘制出熔解曲线。熔解曲线的熔解温度（Tm值）反映了靶序列的特异性。
目前，国内外针对熔解分析技术衍生出多种技术实现路径，以下是目前具有代表性的技术路径。
PCR熔解曲线分析技术在临床中的应用
PCR熔解曲线分析技术在临床中的应用非常广泛，主要体现在以下几个方面：
·
该技术
可用于病原体的快速检测和鉴定
。
·
通过设计特异性引物扩增目标病原体的DNA序列，并结合熔解曲线分析，可以区分不同种类的病原体，甚至
在同一反应中同时检测多种病原体
。这
对于感染性疾病的诊断和治疗方案的制定具有重要价值
。
·
PCR熔解曲线分析技术
能够用于检测基因的单核苷酸多态性（SNP）和突变
。
·
通过监测DNA在加热过程中熔解的温度和熔解曲线的变化，可以
精确识别基因序列中的微小变化，如点突变、插入或缺失等
。这对
于遗传病诊断、肿瘤标志物筛查以及药物敏感性预测等方面具有重要意义
。
·
在耐药基因检测方面，PCR熔解曲线分析技术同样表现出色。
例如，在耐药结核病的诊断中，该技术可以快速检测结核分枝杆菌中的耐药基因突变
，为临床提供及时、准确的耐药信息，指导医生制定合理的治疗方案。
·
在食品工业中，PCR熔解曲线技术可用于检测食品中的过敏原、转基因成分及有害微生物，确保食品安全。
PCR熔解曲线分析技术应用案例及结果解析
国家致病菌识别网呼吸道症候群监测项目是一个由国家卫生健康委统一开展的全国细菌性传染病实验室监测任务之一，纳全生物针对监测方案开发了针对
霍乱弧菌（
Vibrio cholerae
）、副溶血弧菌（
Vibrio parahaemolyticus
）、沙门菌（
salmonella
）、志贺菌（
Shigella
）、空肠弯曲菌（
Campylobacter jejuni
）、结肠弯曲菌（
Campylobacter coli
）、小肠结肠耶尔森菌（
Yersinia enterocolitica
）、艰难梭菌（
Clostridioides difficile
）、阪崎克罗诺杆菌（
Cronobacter sakazakii
）、嗜水气单胞菌（
Aeromonas hydrophila
）、类志贺邻单胞菌（
Plesiomonas Shigelloides
）、河弧菌（
Vibrio fluvialis
）这
12种腹泻症候群病原体鉴别诊断试剂盒
。
产品的具体设计方案如下表所示，即
通过荧光通道和熔解曲线Tm值2个维度的分析，即可实现单个反应管完成12种呼吸道病原菌的鉴别检测
。
·
简单
：加⼀次样，即可完成1个症候群检测
·
精准
：独有超多重荧光PCR技术，灵敏度⾼，特异性好
·
智能
：⾃动辅助判读软件，检测结果⼀键判读，检测数据⼀键导出
适配目前主流具有熔解曲线分析功能的荧光PCR仪器
，包括ABI Q5，BioRad CFX96、宏石SLNA96S以及雅睿MA6000等，具体检测结果如下图所示。
试剂盒进行了充分的分析性能研究，
在特异性、灵敏度上均表现优异，符合足预期性能要求
，下图展示的是部分性能数据。
PCR熔解曲线系列产品均
自带自动判断分析软件NatureView
，qPCR仪导出原始数据 → 数据导入NatrueView → 即
可自动输出判读结果
。
K-ras基因是肿瘤中常见的突变基因之一，其突变与多种癌症的预后和治疗疗效密切相关。为了有效预测癌症患者对靶向治疗的反应，研究人员开发了基于PCR熔解曲线分析的K-ras基因突变检测方法。
针对K-ras基因设计特异性探针，与目标基因的突变位点结合，通过PCR扩增目标基因片段，并在扩增过程中加入探针，利用熔解曲线分析技术，观察探针与目标基因结合后的熔解曲线变化，不同的基因突变会导致探针与目标基因的结合稳定性发生变化，从而改变熔解曲线的形状或Tm值，通过检测这些变化可以识别出K-ras基因的特定突变类型（结果见下图）。
与实时荧光PCR技术比较分析
