抗体寡核苷酸偶联药物（AOC）的精确控制偶联方法

无连接子偶联方法

在无连接子偶联技术中，不需要双特异性连接子作为将靶抗体连接到寡核苷酸上的粘合剂。 通常，这种方法涉及对靶抗体结构的工程设计，以提供用于有效载荷 ONs 顺序偶联的特定生化处理。

氨基酸偶联

无连接子偶联的最常见方法包括用特定的天然或非天然氨基酸工程化靶抗体。通过引入特定的氨基酸，可以精确控制有效载荷ONs的数量和位置，半胱氨酸和谷氨酰胺是用于位点特异性偶联的两种常用氨基酸。

Cuellar et 等人报道了使用基于半胱氨酸的ThioMab技术将ONs共价偶联到还原的抗体上，从而促进siRNA的递送。还有人开发了一种谷氨酰胺介导的偶联方法，利用微生物转谷氨酰胺酶（ mTG ）将赖氨酸叠氮化物转移到靶抗体上，通过无铜点击化学偶联含有二苯并环辛烯（ DBCO ）的siRNA，寡核苷酸-抗体比率为2。

为了克服天然氨基酸的缺点，另一种位点特异性偶联方法是将含有反应性基团的非天然氨基酸（ 如叠氮基、乙酰基 ）引入靶抗体中。例如，在K169和S202，将对乙酰苯丙氨酸（ pAcF ）引入曲妥珠单抗的Fab片段中，使其与羟胺修饰的单链DNA发生肟化反应，形成AOC，然后用于检测Her2+细胞。与天然氨基酸偶联相比，非天然氨基酸偶联更稳定、更有效，然而，抗体工程也相对繁琐。此外，这些非天然氨基酸是否会在人类中引起免疫原性仍不确定。

聚糖偶联

由于IgG在Fc区的CH2或CH3区的N297处携带两条N-聚糖链，远离抗原结合区，确定连接的有效载荷ON的数量和位置相对简单。例如，具有聚糖转移活性的ENGase突变体（ Endo-S，Endo-S2 ）可以产生具有同质聚糖结构的抗体。这种同质聚糖结构包含如叠氮化物和生物素的官能团，可以实现高效合成同质AOCs，并精确控制药物抗体比例在2至12之间。

尽管聚糖结构的高度可变性可能对有效载荷的偶联产生挑战，但糖工程是一种有吸引力的天然抗体功能化生物偶联技术。然而，工程抗体生产过程相对复杂，与其他AOC制备过程相比，不能保证高生产率。

肽偶联

位点特异性偶联可以通过将ON有效载荷偶联到抗体末端的短肽标签来实现，如谷氨酰胺标签（ LLQG ）、Sortase A识别基序（ LPETG ）和SMARTag®（ LCxPxR ）。

转谷氨酰胺酶能够在LLQG的谷氨酰胺侧链与其伯胺之间形成共价键；分选酶a介导的转运可以将五甘氨酸修饰的药物有效载荷转移到LPETG基序上。另一种创新的化学酶方法是SMARTag®技术平台：利用这项技术，甲酰基甘氨酸生成酶（ FGE ）可以将FGE识别基序（ LCxPxR ）中的半胱氨酸转化为甲酰基甘氨酸（ fGly ），抗体就可以通过醛特异性化学转化进行化学修饰，从而产生均匀稳定的偶联物。