沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响

1 仪器和材料

1.1 仪器

Agilent1260 型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；雷磁 PHS-2F-pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司； ZRS-8G 型智能溶出仪，天津天大天发科技有限公司； Spectrum Two 型 FT-IR 红外光谱仪、 Diamond DSC 型差示扫描量热分析仪，美国 PerkinElmer 公司；明美 Mshot MS60 偏振光显微镜，广州市明美光电技术有限公司； PLUS-E2-10TH 衡量分析型超纯水机，南京易普易达科技发展有限公司。

1.2 材料

dl -THP ，质量分数＞ 98% ，批号 YHS20191209 ，西安昊轩生物科技有限公司； dl -THP 对照品，批号 110726-200610 ，质量分数＞ 98% ，中国食品药品检定研究院；牛黄胆酸钠（批号 610L052 ）、鸡蛋卵磷脂（批号 701L021 ）、马来酸（批号 720L023 ），北京索莱宝科技有限公司；羟丙基甲基纤维素（ HPMC K4M ），批号 20180307 ，西安天正药用辅料有限公司；醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯（ HPMC-AS MG ），亚什兰集团，批号 60G-610002 ；聚乙烯己内酰胺 - 聚醋酸乙烯酯 - 聚乙二醇接枝共聚物（ Soluplus ），巴斯夫中国有限公司，批号 66458088Q0 ；其余试剂均为分析纯；用水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 dl -THP 含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为 ODS 柱（ 160 mm × 25 mm ， 5 μm ）；流动相为甲醇 -0.1% 磷酸水溶液（三乙胺调 pH 值 6.0 ）（ 70 ∶ 30 ）；体积流量 1 mL/min ；检测波长 280 nm ；进样量 10 μL ；柱温 37 ℃ ^[13-14] 。

2.1.2 对照品溶液配制 精密称取 dl -THP 对照品 5.20 mg 于 10 mL 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，配制 520 µg/mL 的对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液配制 取待测溶液适量， 0.22 µm 滤头滤过，加 60% 甲醇稀释适当倍数，得到供试品溶液。

2.1.4 线性范围考察 分别取 0.2 、 0.4 、 0.6 、 0.8 、 1.0 、 1.6 mL 对照品储备液， 60% 甲醇稀释定容至 10 mL ，摇匀，得质量浓度为 10.4 、 20.8 、 31.2 、 41.6 、 52.0 、 83.2 µg/mL 对照品溶液。进样测定，以质量浓度为横坐标（ X ），峰面积为纵坐标（ Y ），得到回归方程为 Y ＝ 10.423 X － 14.849 ， R ² ＝ 0.999 1 ，结果表明 dl -THP 在 10.4 ～ 83.2 µg/mL 峰面积与质量浓度线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取“ 2.1.2 ”项下方法配制的 52.0 μg/mL dl -THP 对照品溶液，连续进样 6 次，记录 HPLC 图谱中 dl -THP 的峰面积，计算其 RSD 为 0.26% ，说明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一待测溶液 6 份，按“ 2.1.3 ”项下方法制备供试品溶液，进样测定峰面积，计算 dl -THP 质量分数的 RSD 为 0.96% ，说明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 精密量取适量已测定 dl - THP 质量浓度的待测溶液，平行操作 6 份，按所含 dl -THP 质量比 1 ∶ 1 加入 52.0 μg/mL 的 dl -THP 对照品溶液适量，制备供试品溶液，按“ 2.1.1 ”项下色谱条件进样 10 μL ，记录峰面积，计算平均加样回收率为 99.74% ， RSD 为 0.63% 。

2.2 溶液配制

2.2.1 人工胃液 [ ¹⁵ ] 取牛黄胆酸钠 43.01 mg 、鸡蛋卵磷脂 15.16 mg 、氯化钠 1.368 0 g ，置于至于烧杯中加水适量，超声溶解，转移至 1 000 mL 量瓶中，定容，摇匀。盐酸调 pH 值为 1.60 ^[16] 。

2.2.2 不同 pH 值缓冲液的配制 取 Na ₂ HPO ₄ ·12 H ₂ O 35.82 g 和 KH ₂ PO ₄ 13.61g ，置于 1 000 mL 量瓶中，溶解，定容，摇匀，加 H ₃ PO ₄ 或 4 mol/L NaOH 溶液调 pH 值至各值 pH 值。

2.3 延胡索乙素 pH 值 - 溶解度相图的绘制

2.3.1 晶体平衡溶解度测定（ S _e ） 分别在不同 pH 值缓冲液（ 1.60 、 6.00 、 6.50 、 7.00 、 7.50 、 8.00 ）中加入过量的 dl -THP ，涡旋 5 min 后，超声 20 min 助溶， 37 ℃恒温摇床放置 24 h ，直至平衡， 0.22 µm 滤膜滤过，续滤液用 60% 甲醇稀释适宜倍数后，采用 HPLC 法测定峰面积，计算质量浓度及平衡溶解度（图 1 ）；同时，以 pH 8 时测定的溶解度为未解离时的总溶解度（ C _U ），根据 Henderson-Hasselbalch 方程 ［ C _T ＝ (1 ＋ X ) C _U / X ， X 为 10 ^{(pH － pKa)} ］ 计算不同 pH 值时晶体平衡溶解度（ C _T ，包括解离和未解离 的药物质量浓度）。结果显示 dl -THP 晶体溶解度随 pH 值增大，溶解度明显降低，实测值与计算值无明显差别。

2.3.2 非晶溶解度测定（ amorphous solubility ， S _a ）

参照 Indulkar 等 ^[17] 的方法，将 50 mg/mL dl -THP 的二甲基亚砜（ DMSO ）溶液以 10 µL/min 体积流量加入至 30 mL 含 50 µg/mL HPMC AS MG 的不同 pH 值（ 6.00 、 6.50 、 7.00 、 7.50 、 8.00 ）磷酸缓冲液中，使 DMSO 的最终浓度少于 2% 。 100 r/min 磁力搅拌，每隔 30 s 取样，样品加入紫外比色皿中，测定 450 nm （通过全波长扫描选择药物、 HPMC AS MG 和溶剂均无吸收的波长作为非吸收波长）处的吸光度。记录吸光度数据，通过溶液体积、加入体积流量和时间计算 dl -THP 质量浓度，将质量浓度和吸光度数据导入 Origin 软件，进行曲线分段拟合， 2 条拟合直线交点 - 吸光度发生突变的点，即为非晶溶解度（图 1 ）。

Indulkar 等 ^[17] 研究表明非晶溶解度随 pH 值的变化也遵守 Henderson-Hasselbalch 方程，故也同时通过 Henderson-Hasselbalch 方程，按“ 2.3.1 ”项下方法计算各 pH 值下的非晶溶解度，结果显示，非晶溶解度与结晶溶解度随 pH 值的变化具有相同的趋势，均随 pH 值增大而降低，计算值与实测值无明显差异 。

2.3.3 pH 值 - 溶解度相图绘制 dl -THP 在胃液 pH 值条件下溶解度大，排空至肠液后 dl -THP 所处的环境 pH 值增大，可能产生沉淀降低游离药物质量浓度而影响吸收，故选择可能出现沉淀的肠道 pH 值（ 6.00 、 6.50 、 7.00 、 7.50 、 8.00 ）下测定晶体溶解度和非晶溶解度，阐明 dl -THP 可能发生的相变。将不同 pH 值下的晶体和非晶溶解度数据导入 Graphpad Prism 软件，得到 dl -THP 的 pH 值 - 溶解度相图（图 1 ）。 pH 值 - 溶解度相图分成 3 个区域 ^[3] ：药物质量浓度低于该条件下的结晶平衡溶解度的亚饱和区，该区域内无沉淀；药物质量浓度介于结晶溶解度与非晶结晶溶解度之间的结晶过饱和区，该区域将发生结晶相变；药物质量浓度大于非晶溶解度的不稳定区。

2.3.4 不同 pH 值时的最大过饱和度（ S _m ） 非晶溶解度为最大可达过饱和药物质量浓度，故非晶溶解度与晶体溶解度的比值为该条件下的 S _m ，不同 pH 值时的 S _m 如图 2 所示， pH 值为 6.50 时存在的 S _m 最大，为 9.03 。

2.4  pH 值 转换相行为研究

按文献方法以 dl -THP 临床口服给药量（ 120 mg ）进行 pH 值转移相行为研究 ^[18] 。将 60 mg dl -THP 分散在 125 mL 37 ℃预热的 pH 值 1.60 的人工胃液中，人工胃液中分别含有 0 、 5% （ 24 µg/mL ）、 20% （ 96 µg/mL ）、 50% （ 240 µg/mL ）的 HPMC K4M 、 HPMC AS MG 、 Soluplus 。转速 100 r/min ，分散 20 min ，于 2 、 5 、 10 、 15 、 20 min 分别取液 1 mL 并迅速补液， 0.22 µm 滤头滤过，滤液 60% 甲醇稀释 10 倍，按“ 2.1 ”项下方法测定峰面积，计算质量浓度。取分散后的溶液 30 mL 转移至 60 mL pH 值为 6.50 缓冲液中，并用 200 µL 4 mol/L NaOH 溶液调节转移后的 pH 值为 6.50 。转移后于 5 、 10 、 15 、 30 、 45 、 60 、 90 、 120 、 150 、 180 min 各时间点取液 1 mL 迅速并补液， 0.22 µm 滤头滤过，滤液 60% 甲醇稀释 3 倍，按“ 2.1 ”项下 HPLC 方法测定其质量浓度。将数据导入 Graphpad Prism 软件，得到时间 - 质量浓度曲线（ 3-a ～ 5-a ）、时间 - 过饱和度（ S ）曲线（实测质量浓度 / 晶体平衡溶解度； 3-b ～ 5-b ）、质量浓度 - 时间曲线下的面积（ AUC _{20 ～ 200 min} ； 3-c ～ 5-c ） 。

dl -THP 在 pH 值 1.60 的人工胃液中， 20 min 内 dl -THP 质量浓度为（ 478.79 ± 10.58 ） µg/mL ，转移至 pH 6.50 的磷酸缓冲液后 dl -THP 质量浓度逐渐下降，过饱和度由 3.93 下降至 1 左右，同时出现沉淀。 3 种 PPI 对其在 pH 1.60 条件下中溶出无明显影响。转移至 pH 值 6.50 磷酸缓冲液后， 3 种 PPI 均能够维持 dl -THP pH 值诱导后的过饱和，但作用效果各不相同。浓度为 5% （ 24 µg/mL ）时， HPMC K4M 、 HPMC AS MG 、 Soluplus 作用下 AUC _{20 ～ 200 min} 分别为未加 PPI 的 110.66% 、 174.60% 、 133.91% ，过饱和度分别由 3.93 下降至 1.19 、 1.89 、 1.36 ，浓度为 20% （ 96 µg/mL ）时， HPMC K4M 、 HPMC AS MG 、 Soluplus 作用下 AUC _{20 ～ 200 min} 分别为未加 PPI 的 135.33% 、 189.88% 、 133.91% ，过饱和度分别由 3.93 降至 1.30 、 2.35 、 1.86 。浓度为 50% （ 240 µg/mL ）时， HPMC K4M 、 HPMC AS MG 、 Soluplus 作用下 AUC _{20 ～ 200 min} 分别为未加 PPI 的 141.13% 、 199.28% 、 178.39% ，过饱和度分别由 3.93 降至 1.30 、 2.60 、 2.07 。在不同质量浓度下作用效果均为 HPMC AS MG ＞ Soluplus ＞ HPMC K4M 。分散比较各时间点的过饱和度，浓度为 5% 、 20% 、 50% 时，加与未加 PPI 过饱和度存在显著差异的初始时间分别为 80 、 50 、 35 min ，且随时间的推移各时间点过饱和度均为 HPMC AS MG ＞ Soluplus ＞ HPMC K4M 。由此可知随着质量浓度的增加， PPI 产生作用效果的时间提前。综上所述， HPMC AS MG 维持 pH 值诱导 dl -THP 的过饱和相行为结果最佳。

2.5 沉淀分析

2.5.1 偏光显微镜（ polarized light microscopy ， PLM ）分析 取“ 2.4 ”项下 pH 值转换 180 min 的 磷酸盐缓冲液液体 20 µL ，置于洁净的载玻片上，盖上盖玻片，置于偏光显微镜下、 3 min 内完成观察。偏光显微结果（图