Nature Biomedical Engineering：超声，可促细胞增殖！

奇物论 · 公众号 · · 2024-12-22 22:37

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超声波与生物组织之间物理相互作用的多样性是显着的。超声对器官结构进行成像、检测组织应变和血流量、远程触诊组织机械特性、产热或热消融组织，生成空化或以机械方式破碎像肾结石一样坚硬的固体部件。在这种不断扩大的相互作用范围内， 超声生物效应展示了治疗功能，在保持组织完整性的同时防止局部组织损伤。 例如，传输声强度适中大于安全范围的超声波可以调节神经元活动。低强度超声还可以刺激胰腺 β 细胞释放胰岛素或可逆地打开血脑屏障。最后，超声也被证明可通过募集间充质干细胞有效促进骨折愈合。

对于这些低强度声学生物效应，已经假设了许多可能的解释，包括压力波压缩、声辐射力引起的剪切应变、声流、微空化和组织加热。尽管会引起小应变，但不应忽视纯机械效应（如压力波压缩或剪切）的影响。事实上，发现纤维化引起的静态刚度增加引起的小机械应变会刺激癌症进展的侵袭性。而在成年结肠细胞中，已发现振幅为 1 kPa 的生理蠕动样脉冲肠道菌株在刺激 LGR5 干细胞生理产生的上游机械激活跨膜 SRC 家族激酶 RET 蛋白。

近日， 法国巴黎文理大学医学物理研究所的，欧洲科学院院士、生物医学超声领域的领军人物Mickael Tanter院士与Charlie Demené教授 表明， 低强度聚焦超声可以激活机械敏感的 RET 信号通路。 具体来说，在离体和体内小鼠结肠组织中，聚焦超声诱导结肠隐窝细胞中的 RET 磷酸化。RET 通路的激活是非热的，与声压线性相关，并且与组织中辐射力诱导的剪切应变无关。该研究结果表明， 超声可用于调节细胞增殖。 这对于开发治疗退行性疾病的新疗法可能具有重要意义，同样这些要点对于确认当前医疗超声成像安全法规的有效性非常重要。

超声热、压缩和剪切力的作用：

通过使用适当的超声激活程序，可以解开声辐射力引起的热量、整体超声压缩和剪切对细胞增殖信号激活的相应影响。在本研究中排除了空化，因为实验中的超声刺激参数远低于发生这种空化所需的压力幅度。使用的最高超声强度，在小鼠结肠中声学焦点处估计的最大压力幅度为 2.6 MPa。由该聚焦超声辐射力引起的最大剪切应变为 ~0.38%。在稳态下，最大热升非常低，稳定在 ~0.35% （0.13 °C）。所有这些不同的值都可以根据超声脉冲参数进行调制，即通过改变脉冲持续时间和压力。例如，保持相同的压力但缩短了刺激持续时间，它减少了感应应变和温升，同时保持相同的压力场。

关于刺激方案期间的局部温度变化，没有观察到显着增加。 使用 5 MHz 线性探头测试的所有参数下，温度升高均低于 0.13 °C。 也就是说，在声学仿真中，吸收系数被设置为等于衰减系数，而衰减系数的吸收/散射比在文献中报道的和实际情况相比很糟糕，高估了热源项。 本研究的仿真证实，在这个声学参数范围内，温度不太可能在超声细胞激活中发挥主要作用。 此外，声空化的体内诱导需要非常大的负峰值压力，正如使用聚焦冲击波和超快速差分超声成像的实验证明的那样。该实验的中等声压范围（0.8–4.7 MPa）使任何空化事件的可能性无效，同时也未在超快采集数据中检测到空化事件。因此， 可以排除超声介导的 WNT/β-catenin 信号通路激发的热和空化效应，而只考虑机械效应，无论是体压还是辐射力诱导的剪切效应。

图：聚焦超声可能影响细胞命运的物理效应

声波振幅是 RET 受体激活的主要贡献者：

在排除了温度变化和空化之后，接下来专注于直接机械力。聚焦超声脉冲以 250、125、50 或 20 μs的一系列刺激持续时间，脉冲重复频率为 1、4 或 10 Hz进行工作。这些脉冲分布在不同的空间位置，以对样品的大部分施加压力。每个聚焦光束都会产生局部体积压缩/膨胀，因此在焦点内产生数百纳米范围内的微尺度位移。此外， 每个光束的辐射力产生几微米振幅的瞬态轴向位移，从而诱导横波沿横向传播。

量化 RET 激酶蛋白激活以表征细胞对超声的反应。在小鼠结肠中， RET 是一种在机械刺激后激活的跨膜机械感应受体。在测试的所有超声刺激参数下，超声刺激 1 小时后，RET 激活显著增加近 2倍。 但是，修改压力也会修改剪切应变和声强度。为了测试剪切应变是否参与受体激活，探索在最大压力下从准零剪切应变到最大可实现的剪切应变的超声刺激。 结果显示无论剪切应变百分比如何，都具有相似的振幅，表明 RET 激活不依赖于剪切应变。 在排除剪切应变后，恒定最大压力幅度下刺激结肠外植体，以评估声强对受体激活的影响。 无论强度值如何，RET 激活水平也几乎相同。 这些结果表明， RET 激活不依赖于细胞膜的微米级剪切应变或强度相关效应，而是依赖于由于超声波本身引起的连续整体压缩/膨胀，这表明该机械感应受体对声波振幅敏感。聚焦超声不仅能够激活参与细胞增殖的分子过程，而且还能根据声压水平准确调节这种激活。

图：聚焦超声介导 RET 机械感应受体激活是压力依赖性的

超声可在离体结肠隐窝中迅速过度激活 RET：

为了更好地了解超声刺激如何影响结肠隐窝激活，表征机械刺激之前的基底细胞激活状态。在野生型小鼠结肠中，在每个隐窝 1-3 个上皮细胞中观察到 RET 的生理激活，在近 20% 的隐窝中。基于这一观察结果区 分了 3 种激活状态：pRET 阴性隐窝、每个隐窝 1-3 个 pRET 细胞的 pRET隐窝（生理性），或每个隐窝 ≥4 个 pRET 细胞的 pRET 隐窝（过度激活）。

在高超声压力刺激（3.8-4.7 MPa）后，与低超声压力（0.8-2.7 MPa）刺激的样本相比，每个隐窝 ≥4 个 pRET 细胞的活化隐窝数量显著增加，增加了 2.5 倍。高压下的超声刺激会触发过度激活状态，小鼠离体结肠中过度激活的隐窝数量增加，而较低压力下的超声刺激会随着 1-3 个 pRET 细胞隐窝数量的增加而加强。这一结果最终表明，可以通过调节用于机械刺激的声压来针对性调节高度激活隐窝的水平。此外，RET 激活的调节与剪切应变和声强无关。此外， 较短的超声刺激持续时间足以激活受体 ，因为与 1 小时超声刺激相比，5 分钟超声刺激1-3 个 pRET 细胞隐窝和过度活化的 ≥4 pRET 细胞隐窝的增加无显著性差异。

图：聚焦超声在结肠隐窝中激活 RET 机械感应受体

超声在体内引发 RET 活化和细胞增殖：

对麻醉的野生型小鼠进行了聚焦超声刺激，以测试是否可以在体内调节细胞过程。根据之前的结果，将后续的刺激参数设置为 250 μs、4 Hz PRF 和4.7 MPa。 与对照小鼠相比，超声处理的野生型小鼠在 1 小时后显示 pRET 隐窝的数量显着增加。 进一步评估了另外 3 种已知非机械激活蛋白酪氨酸激酶的磷酸化。进行超声刺激 1 小时后，没有观察到这些蛋白质的磷酸化， 证实 RET 激活对通过超声的机械刺激具有特异性。

为了评估细胞增殖，量化了小鼠结肠隐窝中 Ki67 增殖标志物的表达。 观察到超声机械刺激 12 小时后Ki67 增殖细胞的数量略有增加（与对照小鼠相比增加 1.3 倍），但仅在 1 小时后没有增加。 然后检查了干细胞 LGR5 功能标志物，已知它是 β-catenin 的直接靶标，RET 激活的下游。 实验结果发现LGR5响应 12 小时的超声刺激 ，与对照组相比LGR5隐窝的数量增加了近 2 倍。LGR5干细胞为结肠中的增殖细胞，这一结果证实了超声刺激在激活过度增殖中的效率。总体而言体内实验表明， 聚焦超声刺激可以增加 RET 激活和细胞增殖标志物 Ki67 和 LGR5 的表达。

图：聚焦超声在体内激活细胞增殖

小结：

作者团队发现超声能够在离体和体内结肠组织中激活 RET 通路，其与任何基于热或空化的激活不相容。 这种 RET 激活增加了细胞增殖标志物 Ki67 和 LGR5 的下游表达。这种效应发生在与临床成像相当的安全压力幅度下即可发生。 通过比较超声超声处理后 pRET 隐窝的数量，发现 pRET隐窝的百分比与聚焦时的声压呈线性关系。 在相似的 4.7 MPa 压力下，发现通过声辐射力将完全不同的剪切应变诱导到组织中会产生类似的激活，这表明与机械剪切应变相比，最大声压至关重要。最后，在相似的 4.7 MPa 压力下，发现诱导完全不同声强产生相似的激活，再次证明了与时间平均声强相比，最大声压对 RET 激活的主要影响。

由于发现压力振幅是 RET 激活的主要因素，因此超的持续时间并不起主要作用：5 分钟的持续时间与 1 小时的持续时间相似的 RET 激活水平。这种较短的激活超声处理时间是一个有趣的特征，因为它有可能实现 RET 通路的超声调节。此外，超声技术可以非常精确地控制承受高振幅压力的区域的空间范围。 这种对空间和时间的精确控制是通过对压力幅度的依赖性实现的，这为使用超声对 RET通路的调节进行潜在的精确和远程控制铺平了道路。

Nature Biomedical Engineering：超声，可促细胞增殖！

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