今天讲的这篇文章有点意思，讲的是在免疫抑制微环境中，TKI（酪氨酸激酶抑制剂）的耐药过程的变化。这篇文章就是复旦大学附属华山医院神经外科的博士生，发表在48.8分的Cell大子刊上的文章。这篇文章做的主要是LCBM（肺癌脑转移）的TKI耐药，TKI大家应该都知道，是用来抑制RTK（酪氨酸激酶）的，比如突变了的EGFR（EGFR这样的RTK其实可以作为很多信号通路的膜受体，来传递信号，比如MAPK信号通路、ErbB信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路等等，不熟悉这些信号通路的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下）。但是在LCBM中，TKI经常会有耐药的现象：
于是他们就想看看TKI在治疗LCBM过程中，是否会造成免疫细胞微环境的影响，从而导肿瘤脑转移过程中产生了免疫抑制。首先他们就对于LCBM患者，进行了单细胞测序（下面这个UMAP图，就是通过单细胞测序活动的，通过基因表达作为多维的主成因分析，并进行降维成这样的2D图形，通过这样的图来对不同的基因表达特征的细胞进行分簇分析，UMAP和tSNE都是这样的原理，这个在《列文虎克读文献》和《夏老师带你读文献》里也介绍过）。从众多的RTK突变样本中，他们发现NSCLC（非小细胞肺癌）中，EGFR和ALK的突变与LCBM中T细胞浸润水平降低有关。而TKI用药后，LCBM则过于表现出更高比例的T细胞浸润。也就是说，内在的EGFR和ALK的驱动突变会影响免疫微环境，而TKI治疗则会增强T细胞浸润：
通过对单细胞测序的进一步分析，他们发现TKI治疗后，还能影响T细胞的分化。而在TKI处理病例的T细胞中，经典免疫检查点CTLA4明显上调（CTLA4应该不用特别介绍了吧，在免疫检查点中和PD1齐名，CTLA4可以抑制TCR信号通路，也能通过SHP1来抑制PI3K-AKT信号通路，不清楚的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列）。TKI虽然可以逆转EGFR突变型LCBM中的T细胞缺陷，但同时也通过上调CTLA4表达来减弱了T细胞效应功能：
接着他们进一步分析了单细胞测序中另一种免疫细胞群体，TAM（肿瘤相关巨噬细胞）。他们发现TKI治疗后，MDM（单核细胞衍生的巨噬细胞）和小胶质细胞成为了LCBM中最丰富的两个髓系细胞亚群。而通过单细胞测序的配体受体分析，则发现MDMs和T细胞之间，表现出了更多的配体-受体相互作用。也就是说在TKI治疗后，MDM和T细胞之间，可能存在Crosstalk。在这个假设迭代提出后，接着他们就进了相应的实验进行了验证，通过MDMs和T细胞的体外共培养系统，他们发现TKI处理的肿瘤细胞的条件培养基培养巨噬细胞系，会导致T细胞迁移增加，也就是说TKI治疗后，会使得巨噬细胞驱动T细胞的浸润：
然后，他们就进行了小鼠体内验证，建立了一个LCBM小鼠模型，来进一步分析TKI对于LCBM的微环境影响。结果发现TKI能有效抑制肿瘤增殖，但与此同时TKI也会增加T细胞上CTLA4的表达，削弱T细胞功能，从而增强维持免疫抑制微环境：
TKI可以诱导ICD（免疫原性细胞死亡）,这是一种炎症性的细胞死亡形式，其特点是分泌DAMP（损伤相关分子模式），如HMGB1和CALR等。通过共聚焦分析，他们发现TKI治疗，触发了EGFR突变型小鼠肺癌细胞中HMGB1从细胞核到细胞质的易位，而HMGB1能通过Toll样受体信号通路激活巨噬细胞的NFκB信号（Toll样受体信号通路以及下游激活的NFκB信号通路都是比较常见的信号通路，这里他们分析的p65其实就是NFκB信号入核激活转录的部分，不熟悉的话，可以看看《信号通路是什么鬼？》系列，都介绍过），他们通过对巨噬细胞使用不同的TLR抑制剂进行逐一排查，发现HMGB1可以通过TLR2激活巨噬细胞的NFκB信号，从而导致趋化因子表达：
同样TKI导致的肿瘤细胞ICD，所产生的HMGB1，也会对T细胞产生影响。通过使用NFκB的抑制剂后发现，HMGB1与NFκB信号偶联，是上调T细胞中CTLA4表达的分子驱动因素（其实这一部分验证，并不是特别严谨，通过抑制剂或者阻断剂，其实会导致肯定后件的逻辑谬误，在逻辑验证过程中，会显得不太严谨，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。而HMGB1也能促进，NFκB信号通路中p65对于TSS（转录起始位点）附近启动子区域的结合：
用这个示意图显示，就是TKI治疗，会导致肿瘤细胞的ICD，并释放HMGB1。而HMGB1可以通过激活巨噬细胞中的NFκB信号通路，释放细胞因子招募T细胞。同时肿瘤细胞来源的HMGB1也能激活T细胞中的NFκB信号通路，导致T细胞的CTLA4表达增加，减弱T细胞功能，产生免疫抑制微环境：
既然CTLA4是导致免疫抑制微环境的关键，而CTLA4的表达增强又是由于TKI引起。于是他们就提出了新的假设，是否CTLA4的抑制剂，协同TKI治疗，会起到更好的效果呢（其实假设的迭代，就是建立在研究不断推进的过程中的， 通过研究结果的推进，在新的结果的基础上推进假设，就是假设的迭代，不清楚的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）？于是就进行了小鼠体内实验，结果发现TKI与CTLA4阻断联合治疗，不仅对TKI敏感突变型LCBM有效，而且对TKI耐药突变型的LCBM也有效：
这个过程其实就是在TKI治疗后，由于TKI导致的ICD，引发了一系列连锁反应，导致浸润的T细胞中CTLA4的表达增加，导致了T细胞的功能障碍。而使用CTLA4的阻断剂，则能使得T细胞重新振作，使得TME中的T细胞重新发挥功能的效果：
今天这篇文章其实从研究过程，到研究思路上，都是不错的。在部分验证过程中，还是有一些小瑕疵。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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