今天为大家带来一个新的国自然热点——乳酸化修饰（Lactylation），可以直观的看出，2020年的资助项目为7项，4年时间，资助项目直接到了126项，翻了18倍。可想而知，大家对这一新兴热点研究的火热程度有多高。
如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问，可以联系我们进行咨询：
扫码备注：科研合作
今天就同大家来解析一下乳酸化修饰相关的研究应该怎么做，小编在这里分享一篇由上海交通大学医学院附属瑞金医院张瑞岩/闫小响团队发表在Circulation Research（IF 16.5）杂志上的文章，看看这方面的故事逻辑应该怎么叙述，相关的实验技术又有哪些。
NR4A3（关键分子）缺失可以保护血管平滑肌细胞的收缩表型，抑制成骨分化相关基因表达，并减少血管中的钙沉积。NR4A3通过直接结合到糖酵解基因ALDOA和PFKL的启动子区域，增强糖酵解活性，进而促进乳酸生成和组蛋白乳酸化（国自然热点：乳酸化修饰）。此外，NR4A3介导的组蛋白乳酸化通过上调磷酸酶孤儿1（Phospho1）的表达（具体通路），促进动脉钙化。研究结果为预防血管钙化提供了新的治疗靶点。
1、为何选择NR4A3作为本研究关键分子？
NR4A3（核受体亚家族4组A成员3）是一种孤儿核受体，之前的研究已经显示它在载脂蛋白A-IV诱导的动脉粥样硬化进展中是一个关键调节因子。然而，它在血管钙化中的作用尚不清楚。这就说明，这个分子在血管领域的研究有一定的基础，但是在血管钙化这个生物学现象中存在空白，研究具有科学价值。
2、作者如何将NR4A3与血管钙化联系起来的？又是如何进行验证的？
由于血管平滑肌细胞是血管壁中的主要细胞类型，它们在血管钙化过程中会发生表型转变，从收缩型转变为成骨型，导致血管钙化。因此，作者着重研究了NR4A3在调节VSMCs的表型转变中所起作用。
在这里，作者的建模很有意思，大家可以学习一下类似的思路。作者构建了NR4A3基因敲除（NR4A3−/−）小鼠模型，并在这些小鼠中诱导了两种不同类型的血管钙化模型。此外，还利用血管平滑肌细胞特异性的过表达系统，通过尾静脉注射携带SM22启动子的腺相关病毒9（AAV9）载体或AAV9-NR4A3，来在小鼠的血管平滑肌细胞中过表达NR4A3。随后，通过收集C57BL/6小鼠的不同钙化模型的主动脉组织，使用Von Kossa染色和免疫组织化学染色来评估NR4A3在钙化组织中的表达水平，并通过β-甘油磷酸盐（β-GP）刺激分离的血管平滑肌细胞（VSMCs），观察NR4A3表达的变化，并评估其对VSMCs成骨分化相关基因表达和钙沉积的影响。
3、作者是如何找到葡萄糖代谢这条机制？又是如何验证的？
通过Seahorse XF96细胞外流量分析仪监测细胞的氧气消耗率和细胞外酸化率，评估NR4A3对糖酵解功能的影响。实验发现，NR4A3过表达的VSMCs显示出更高的基础和补偿性糖酵解水平。进一步，作者使用液相色谱-质谱（LC-MS）技术对VSMCs进行靶向代谢组学分析，检测了NR4A3过表达和对照组细胞之间的代谢物差异。结果发现，NR4A3过表达的细胞中多个糖酵解途径中间产物和三羧酸循环中间产物显著增加。随后，RNA-seq的分析，也提示了糖酵解相关的基因表达水平在NR4A3−/− VSMCs中下调。为了进一步挖掘其中的靶点，作者使用RT-qPCR来验证RNA-seq和CUT&Tag分析中发现的候选糖酵解基因的表达变化，并关注到了ALDOA和PFKL这两个基因，因为这两个基因在NR4A3−/− VSMCs中表达下调，并且CUT&Tag分析显示NR4A3与这些基因的启动子区域有结合。这一步作者通过干湿结合的方式，使得这一条机制的证据也更加的solid。
4、最终作者又是如何定位到乳酸化的？具体是怎么验证的？
实际上，乳酸化修饰是葡萄糖代谢中非常重要的一环，作者也通过WB和免疫荧光技术检测VSMCs中乳酸化修饰的水平，特别是在钙化条件下，发现乳酸化水平显著增加。并且，分别通过乳酸化抑制剂实验和乳酸补充实验发现乳酸确实对血管钙化起着重要影响。进一步的，作者通过整合H3K18la CUT&Tag和RNA-seq数据，识别NR4A3介导的乳酸化修饰的下游基因，特别是Phospho1。随即，通过在NR4A3过表达的细胞中添加Phospho1抑制剂MLS-0263839，验证Phospho1的激活是否是NR4A3促进血管钙化所必需的。
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）分析：这是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的表观遗传学技术，用于确定NR4A3在基因组中的结合位点。（PS：这一技术是Henikoff实验室在2019年于Nature Communication上公布的，将原本ChIP-seq实验的细胞量需求从原先的10,000个大幅降低到了60个，甚至单个细胞）
Seahorse XF96细胞外流量分析：用于实时监测细胞的氧气消耗率和细胞外酸化率，评估NR4A3对线粒体呼吸和糖酵解的影响。
其他的实验技术就是大家日常熟悉的了：构建小鼠模型，构建由AAC介导的过表达细胞系、LC-MS技术、WB、ChIP-qPCR等。
1、财力+技术，装备好就是硬实力！
正所谓巧妇难为无米之炊，实验平台的实力和研究者的成果水平息息相关。本文通过整合RNA测序、CUT&Tag分析和代谢组学等多组学，研究全面地描绘了NR4A3在血管钙化中的调控网络。这种多维度的研究方法提高了科学发现的深度和准确性，为复杂疾病的机制研究提供了强有力的工具。
2、临床转化价值
首先是揭示了NR4A3通过增强糖酵解和促进组蛋白乳酸化（特别是H3K18la），在血管钙化中发挥关键作用的全新机制。但是光解释机制还是不够的，本文更进一步发现了NR4A3在血管钙化中的重要作用，还通过药物干预实验验证了靶向NR4A3及其下游效应分子Phospho1的潜在治疗策略。
这里同大家再分享一篇有关乳酸化修饰的文章，不过本文的研究疾病是肝脏纤维化。
在这一过程中，肝星状细胞（HSCs）的激活是关键事件，而代谢重编程（特别是糖酵解增强）在HSCs激活中起着重要作用。作者发现糖酵解的关键酶——己糖激酶2（HK2）在HSCs激活和肝脏纤维化中起着至关重要的作用。HK2通过促进糖酵解，增加乳酸产生，进而可能通过乳酸化影响基因表达。
在验证过程中，作者通过在HSCs中诱导HK2表达，研究者观察到乳酸化水平上升，特别是组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酸化（H3K18la）。与上文类似的，作者利用RNA-seq和CUT&Tag染色质分析，研究者发现HK2诱导的乳酸化在HSCs激活过程中促进了特定基因的表达，而不是通过传统的组蛋白乙酰化途径。此外，作者通过在小鼠模型中特异性或系统性地敲除HK2，研究者发现可以减轻肝脏纤维化（与上文类似的构建关键基因缺失的小鼠模型）。并通过补充外源性乳酸，可以逆转HK2缺失对HSCs激活的抑制作用，表明乳酸化在HSCs激活和肝脏纤维化中起着关键作用（与上文类似的补充外源性乳酸）。本文最终也证实通过抑制HK2或乳酸生成，可以减少H3K18la水平，从而抑制HSCs的激活和肝脏纤维化。可以看得出来，有关乳酸化的研究，其中很多的实验思路都是类似的，若是大家已有思路，不妨可以借鉴一下以往发表的高分文章，还是可以为自己的文章指引方向的。
