今天继续聊测序技术平台，聊的是Pacific Biosciences 或者大家更熟知的名字第三代测序领导者 PacBio.
PacBio成立于2004年，由Stephen Turner博士和Jonas Korlach博士在康奈尔大学的基础研究基础上成立。
PacBio的核心技术基于
单分子实时测序
（Single Molecule, Real-Time Sequencing, SMRT）。SMRT技术的核心在于
零模波导（zero-mode waveguides, ZMWs），ZMWs是PacBio 测序
流体芯片
上数百万计的纳米级圆柱形凹槽。
这些纳米级的小孔能够捕捉并固定单个DNA分子，同时允许DNA聚合酶在其内部进行复制过程，对单个DNA分子进行实时观察和分析。
PacBio的测序模式有“长读长” 和 “短读长” 两个平台，分别针对不同的应用场景。
PacBio HiFi Sequencing 测序技术通过SMRT原理实现了测序长读长和高准确性。PacBio的另一项测序技术是Sequencing by Binding（SBB），PacBio SBB 技术主要针对短读长测序。
先讲PacBio“长读长”平台 - HiFi Sequencing 的工作原理。
在PacBio HiFi Sequencing 技术平台上一张测序芯片表片排列15万个直径为70纳米的测序微孔（ZMWs）。
首先样本DNA的环化片段被固定在纳米级的小孔的底部，
DNA聚合酶在样本DNA上添加游离的核苷酸，开始复制过程。
PacBio HiFi Sequencing 使用的是边合成边测序的原理（Sequencing by Synthesis, SBS）。
在过程中游离的
dNTP
被固定在底部的酶捕获，同时被小孔底部激发光激发。
由于测序小孔直径很小，激发光穿透能力会逐渐衰减，只能在小孔中传输很短的距离，只有当dNTP足够靠近底部连接的荧光基团才会被激发光照到发出荧光
。
在测序过程中，微孔内合成测序每添加一个新的核苷酸，就会发出微量的光，由探测器捕捉。通过测量发出的光信号，确定添加的DNA碱基类型。
通过多次复制同一DNA片段，HiFi测序能够通过circular consensus sequencing （CCS）提高序列的准确性
。
在HiFi Sequencing 过程中，
如果样本DNA中的碱基有甲基化修饰，SMRT 原理的合成测序（SBS）速度会明显变慢，而且光谱也会发生改变。
HiFi测序提供15,000至20,000碱基对或更长的读数，使研究人员能够组装参考级基因组和全长RNA转录本。
Sequencing by Binding（SBB）是PacBio的另一个高准确度“短读长”测序平台技术。
Next Generation Sequencing（
NGS
）技术虽然在成本和通量上有所优化，但短读序列的准确性提升有限，通常为每1000个碱基中1个错误（Q30）。PacBio SBB测序技术平台能够生成极低错误率（每10000个碱基中1个错误或更低，Q40+）的序列读数。
PacBio“短读长” 平台 - SBB的工作原理
，
第一步使用聚合酶在DNA链上启动测序过程，3'端带有可逆阻断剂。荧光标记的碱基流入测序单元，与DNA链上的合适位置结合并发出信号。移除3'端的可逆阻断剂，激活下一个碱基的结合。
与SBS技术不同，SBB技术中标记的核苷酸不会被整合到DNA链中，而是在信号被捕捉后被冲走。
由于SBB技术中荧光标记的碱基不直接整合到DNA链中，避免了SBS中荧光标签移除后残留的分子疤痕。
按照惯例，讲了这么多技术，接下来上价值。
PacBio年初吹的牛逼很丰满，现实却很骨感。感觉牛逼属实还是有点难实现啊，我们拭目以待吧。
