今天讲的这篇文章，是中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院团队发表在27.7分的Mol Cancer上的文章，谈不上多好，只能说是一篇中规中矩的circRNA研究，一作是湘雅医学院附属肿瘤医院中心实验室的博士。通过这篇文章，我们可以进一步思考一下circRNA到底还有什么可以改进的地方，顺便再捋一捋科研的逻辑（实际上这个是大家在科研工作中最欠缺的一部分，不清楚科研逻辑的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）：
这样的circRNA研究的第一步是确定circRNA，他们首先分析了circRNA产生的序列，并且分析了circRNA的表达情况，并与circRNA的宿主基因进行了对比，发现了差异（这里其实就是柯霍氏法则的验证，通过这样的比对，把差异表达的circRNA与疾病表型进行了绑定，然后才能进一步提出假设，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。然后他们分析了差异表达的circRNA与疾病预后的关系，其实也是对于表型进行的关联性绑定：
为了确定这个circRNA的功能，他们进行了敲减和过表达的实验，来进一步分析circRNA对于肿瘤表型的贡献（通过敲减或者过表达来分析表型，其实也就是反向遗传学的研究方法，通过改变基因表达来分析基因与表型之间的关联性，不清楚反向遗传学的话，可以去看看《轻松的文献导读》）。他们发现在circRNA在体内外都能影响肿瘤的增殖和迁移侵袭：
那么问题来了circRNA是通过什么机制来影响这些表型的产生的呢？他们通过对分析了circRNA过表达后的蛋白谱，通过上下调蛋白表达的变化（下图的火山图，其实就是分析circRNA表达后，对于下游蛋白表达的影响，不清楚火山图的话，可以去看看《夏老师带你读文献》复习下）。而在这些基因中，他们筛选到了c-Myc、cyclin D2和CDK4的蛋白表达可能受到了circRNA的影响：
c-Myc、cyclin D2和CDK4的这些蛋白，其实和细胞增殖，以及细胞周期以及细胞的EMT（上皮间质转换，这里提到的EMT和细胞周期等信号通路在肿瘤增殖、迁移侵袭等等方面都有着比较重要的作用，要是不清楚EMT信号通路和细胞周期信号通路的话，可以回去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列）：
在这里他们分析了circRNA和c-MYC之间的关联性，通过过表达circRNA后敲减c-MYC，或者敲减了circRNA后过表达c-MYC，来分析circRNA和c-MYC对于表型的上下游关系，这里的表型是增殖与迁移侵袭。其实这两张Figure的验证是整篇文章逻辑最薄弱的部分（这里就涉及的肯定后件的逻辑谬误，由于c-MYC的下游并不止一个，而circRNA的下游也不止一个，所以这一步的验证过程，并不能说明任何问题，在没有直接证据的情况下，很难把circRNA和c-MYC之间与表型的关联性整合在一起，不清楚的话，可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）：
他们在假设circRNA和c-MYC及表型之间的关联性已经建立的情况下，分析circRNA对于c-MYC的翻译产生的影响，结果发现circRNA可能会通过结合c-MYC的mRNA，从而提高c-MYC的翻译效率（但说到底这可能不是circRNA的唯一功能），其实如果在这一步加一个实验，就是突变了c-MYC上与circRNA的结合位点后，过表达circRNA无法再影响肿瘤相关的增殖和迁移侵袭表型产生，那么这一步的验证就会变得相对严谨了：
于是，他们就需要把这里的假设进行进一步迭代并补完，他们通过筛选circRNA的结合蛋白，并分析circRNA表达影响的蛋白质，发现circRNA能结合eIF4A3，eIF4A3是翻译起始因子家族的成员，circRNA和eIF4A3结合能影响c-MYC的蛋白表达。同时circRNA与eIF4A3结合，可以抑制eIF4A3的核易位，从而促进c-MYC的蛋白表达：
最后这个示意图吧，其实并不算是特别严谨，因为在circRNA和c-MYC之间与表型的关联性这一步上，再通过c-MYC影响细胞周期信号通路以及EMT信号通路的话，可能就不能直接做出这样的推理了（这样的逻辑漏洞，其实非常常见，如果在研究的过程中思路一个不清晰或者不小心都会犯这样的逻辑错误，不清楚这样的逻辑漏洞的话，可以看看《列文虎克读文献》、《信号通路是什么鬼？》系列和《科研的推理和逻辑——从实验台到咖啡桌》）：
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