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早在1866年，德国植物学家Anton de Bary就以“共生”一词形容地衣真菌和藻类的互利关系，Anton de Bary将“共生”定义为由于生存需要，两个或多个生物之间按照某种模式互相依存和相互作用，形成共同生存、协同进化的自然现象。植物自定植于陆地以来便与微生物形成密切的共生关系，这种关系影响了植物的生长、发育、抵御生物胁迫及非生物胁迫等重要生理过程，进而影响了农作物、花卉、药材等植物的产量与品质。

自然界中，存在许多植物和微生物共生的现象，常见的共生体系如根瘤菌与豆科植物共生、弗兰克氏菌与非豆科植物共生、菌根真菌与植物共生、蓝细菌与植物共生、叶际微生物与植物共生等。其中，菌根真菌与植物根系所形成的互惠共生体即菌根（Mycorrhizals），在自然界中普遍存在，对维持自然生态的稳定发挥着关键作用。这种共生关系有助于改善植物营养、调节植物代谢和增强植物抗病能力，所以菌根真菌常被用作生物菌剂为农作物增产。菌根主要包括丛枝菌根（Arbuscular Mycorrhiza，AM）、外生菌根（ECM）、杜鹃花菌根（ERM）和兰科菌根（ORM）四种类型，其中，AM在自然界中分布范围最广(Choi et al., 2018)。在本文中，伯小远将带你探索丛枝菌根共生这种奇妙的“伙伴”关系，了解植物和AM真菌建立共生关系的过程、以及这种关系对生态系统的重要性。

基于化石研究和真菌系统发育分析，AM真菌的进化史可追溯到奥陶纪（4-4.5亿年），这个时间与早期陆地植物的出现相吻合，AM真菌被认为促进了植物从水生到陆生的进化，是共生菌界的始祖。AM的宿主范围最为广泛，能与超过72%的陆地植物形成共生关系(Choi et al., 2018)，如苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物，其中包含重要的粮食作物，如水稻、小麦、大豆等。

AM真菌是一类专性营养型真菌，如果没有宿主，就无法完成其自然生命周期，真菌需要从植物根系获得以脂肪酸为主的碳源和促进生长的物质。为了建立AM真菌的非共生培养体系，研究者们开始尝试在培养基中添加各种脂肪酸或脂质。虽然证明肉豆蔻酸以及棕榈酸可以作为AM真菌生长和孢子形成的碳源和能源(Sugiura et al., 2020)，但是这种情况下孢子的萌发率和侵染率还是远远不如自然共生条件下的孢子。在目前的实验条件下，仍难以实现对AM真菌的纯培养。

AM共生的建立大致可以分为三个阶段：1）早期：预共生交流、接触和侵入；2）中期：丛枝形成和营养交换；3）末期：丛枝衰亡以及泡囊和孢子形成。这些阶段在根的单个感染部位持续性发生，但AM共生是异步过程，其特点是同时存在所有的上述步骤(Choi et al., 2018)，但对于刚建立共生的植物来说，大部分感染组织还是会处在一个时期，整个根水平上侵染部位基本处于同步。

在物理接触之前，植物和AM真菌会向土壤中释放可扩散分子以吸引它们的共生伙伴，并启动共生基因的转录以进行侵染。独角金内酯（Strigolactones，SLs）是重要的植物根系分泌物，能够促进AM真菌的代谢和菌丝分枝(Waters et al., 2017)。在缺磷的情况下，植物的ABC转运蛋白会向根际输出SLs，在土壤中产生浓度梯度，这为引导AM真菌向宿主根部移动提供了位置线索(Kretzschmar et al., 2012)。在受到SLs诱导后，AM真菌会分泌菌根因子，包括脂壳寡糖（Myc-LCO)、短链壳四糖（CO 4 ）和壳五糖（CO 5 ），它们会激活植物中菌根共生信号通路。在根瘤共生中也存在类似的共生信号通路，被称为共同共生信号通路（CSSP）。病原真菌也具有类似的寡糖结构，如长链寡糖CO 8 。寡糖的感知在植物细胞表面由受体样激酶（RLKs）介导，该类RLKs在细胞外结构域中含有能够与寡糖识别并结合的赖氨酸基序（LysMs)，LysM结构域是识别不同微生物启动免疫的关键，同时也是共生的关键(Zhang et al., 2021)。

在根际相互识别后，AM真菌会与根表皮细胞发生物理接触，其菌丝顶端发生膨大并吸附在细胞表面，从而形成附着胞（Hyphopodium）。而宿主植物通过构建称为预穿透装置（Prepenetration apparatus，PPA）的管状结构引导真菌的侵入，需要宿主的细胞结构发生重排以及共生相关基因的表达。PPA是由内质网和细胞骨架支撑的内陷型质膜网络。一旦产生PPA，真菌附着胞接触部位的植物细胞壁会软化，允许AM真菌菌丝进入植物质外体。在表皮穿透后，真菌的根内菌丝通过PPA的持续形成在外皮层细胞间或细胞内延伸(Genre et al., 2008)。真菌进入的细胞中会观察高频的钙离子震荡，而在相邻细胞中只观察到低频的钙离子震荡(Sieberer et al., 2012)。

图3 AM共生的过程(Martin Parniske, 2008)。植物根系分泌SLs，诱导孢子萌发和菌丝分枝，增加真菌孢子和菌丝的生理活性。SLs还可以诱导寄生植物（如独角金）的种子发芽。

真菌菌丝进入细胞内首先会形成主干部分，然后经过连续地双叉分支形成灌木状结构。伴随着细胞内真菌的发育，宿主植物会形成同样的树状膜结构包裹着正在生长的真菌，这样的结构最大程度地扩大了两者之间的接触面积，真菌质膜和植物树状膜结构之间的间隙是进行广泛物质交换和共生信号交流的场所(Genre et al., 2008)。这样以细胞为单位的共生结构被称为“丛枝”（Arbuscule），其中的植物树状膜结构被称为“丛枝周膜”（Periarbuscular membrane，PAM），间隙被称为“丛枝周间隙”（Periarbuscular space，PAS）。植物细胞中存在丛枝这一结构，才能确定AM真菌与植物根系形成了菌根，该类菌根也由此而得名。

AM共生的标志是植物与真菌在丛枝中进行营养物质交换。AM真菌提供磷和氮以换取有机碳。真菌提供的多磷酸盐到达根内真菌结构中，被水解成无机磷酸盐并运输到PAS，植物通过PAM上共生特异性的无机磷酸盐转运蛋白如MtPT4/OsPT11获取磷酸盐(Yang et al., 2012)。同样地，真菌从土壤获得的氮以氨基酸（谷氨酸和精氨酸）的形式到达丛枝，在转化为尿素和氨之后，被释放到PAS中，铵转运蛋白如MtAMT2;4通过PAM将铵盐转运给植物(Breuillin-Sessoms et al., 2015)。

作为获得磷和氮的回报，植物以糖和脂质两种形式向AM真菌提供光合产物。在PAS中，蔗糖被分解为己糖，葡萄糖被真菌获取并转化为海藻糖和糖原的形式进行储存(Roth and Paszkowski, 2017)。此前科学家一直认为糖是共生真菌利用的主要碳源。直到2017年有研究显示，长链脂肪酸（Long-chain fatty acid，FA）是AM真菌从宿主植物中获取的主要碳源(Sugiura et al., 2020)。AM真菌缺乏参与FA生物合成的基因，因此依赖于宿主提供FA。通过植物表达乙酰ACP硫酯酶（FatM）、甘油三磷酸酰基转移酶（RAM2）等FA生物合成相关蛋白，最终合成C16:0 β型单酰基甘油（C16:0 β-MAG），在细胞质中C16:0 FA转变为二酰甘油（2-MAG）。PAM定位的脂质转运蛋白（STR/STR2）将2-MAG转运进丛枝，在丛枝中被转化为三酰甘油（TAG）直接用于真菌的生长和发育或储存在真菌细胞中(Jiang et al., 2018)。

图5 AM共生营养物质交换和丛枝周膜形成的模型(Jiang et al., 2018)。 在含丛枝结构的细胞中，WRI5s通过调节参与脂肪酸生物合成和脂质转运蛋白的几个关键基因的表达，控制AM共生过程中的脂质转移和丛枝周膜的形成。 此外，WRI5s还可以激活磷酸转运蛋白MtPT4的表达，并在AM共生过程中调节磷的转运。 在该模型中，WRI5a和GRAS结构域转录因子RAM1在转录水平上相互调节，形成一个正向调控循环，协同调控共生体之间的双向营养物质交换。

尽管细胞形成和维持丛枝结构付出了巨大的努力，但它们是短暂的结构，寿命只有几天。控制与丛枝衰老相关的细胞动力学机制尚不清楚。菌丝降解从细小分枝开始并逐渐向主干延伸，随后真菌细胞质收缩，并伴随着隔膜的增加。使用活体染色发现，即使在丛枝分支时，主干仍保持活力，这归因于在主干底部形成了明显的隔膜，将退化的菌丝与活菌丝分开。在形成成熟丛枝之后，AM真菌开始产生脂质储存的场所“泡囊”，在丛枝开始衰亡时，植物根系会出现大量AM真菌所产生的泡囊。同样地，丛枝成熟以后，也开始形成无性孢子，除了含有细胞核外，它们还有以TAG形式储存的脂质，以支持孢子萌发和非共生胚管生长。尽管尚不清楚泡囊和孢子的形成是如何被调节的，但相关证据表明，泡囊形成与宿主的脂质转移有关(Keymer et al., 2017)。

AM共生在生态系统中有着重要的功能，包括促进植物吸收磷等营养物质、提高植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力、增加生态系统的多样性等等。

在土壤中大部分的磷以难溶性有机磷酸盐的形式存在，不能被植物很好地直接吸收利用，但磷是一种必需的大量矿质营养元素，在植物细胞干重中占比为0.2%左右，而AM真菌能够给植物提供所需总磷的70% - 100%。AM真菌菌丝会从植物根内生长到根外，最高延伸至100立方米的土壤中，扩大了植物吸收磷的范围。致密的菌丝网络联系了多种植物根系，同时还包含了土壤中的微生物如解磷菌，该菌能将难溶的磷酸盐分解。同时，AM真菌会渗出有机物质，如有机酸、磷酸酶、多胺、球囊霉素等物质，这些物质不仅能使有机矿物形成团粒结构(Li et al., 2022)，增加土壤中团聚体的螯合作用，而且有机酸或磷酸酶能够活化难溶性磷酸盐，促进有机磷转化为无机磷。这不仅使无机磷在根系富集，还能减少磷氮等多种养分的浸出，使整个生态系统产生封闭的养分循环，长期提高土壤肥力，有利于植物对土壤营养和水的吸收利用。

AM真菌能够提高宿主植物对非生物和生物胁迫的抗性(Shi et al., 2024)。AM真菌定殖植物对干旱和盐胁迫的抗性增强的机制包括：①通过诱导脯氨酸和可溶性糖的积累来缓解渗透胁迫；②通过增加气孔导度和叶绿素含量来提高光合作用的效率；③在干旱胁迫条件下，AM真菌通过增加根长和根毛密度以提高植物的吸水量，提高植物SLs的分泌量以促进AM共生；④防止植物过量摄取Na + ，以维持盐胁迫下的离子稳态；⑤通过提高抗氧化酶如CAT、SOD和POD的活性来清除ROS，从而抵抗氧化胁迫（图6）。

在生物胁迫条件下，AM真菌通过以下方式保护宿主植物免受病原体感染：⑥增强宿主植物的系统防御反应并诱导免疫抗性基因的表达；⑦提高植物根系合成和分泌对病原菌具有排斥性的酚类和异柠檬酸盐的含量，从而减少昆虫、病原菌的入侵；⑧形成细胞壁沉积物以阻碍病原菌在植物内的生长（图6）。

除了上述的作用外，研究人员发现AM共生还具有缓解土壤重金属污染和生物修复放射性核素污染等方面的功能(Han et al., 2021)，并通过根外菌丝网络调节植物群落结构和演替，深刻影响了生态系统结构和功能的稳定性，与无AM真菌存在的环境相比，AM共生显著增强了生态系统的多样性。

2023年9月，华东师范大学姜伊娜课题组联合中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛课题组在 Nature Communications 杂志 上发表题为“Control of arbuscule development by a transcriptional negative feedback loop in Medicago”的研究论文，该研究发现，AP2/ERF家族蛋白ERM1/WRI5a-ERF12-TOPLESS转录复合体构成了一个负反馈回路，灵活调控营养交换和丛枝发育过程，从而维持互惠共生关系的稳定。

首先，作者通过双分子荧光互补实验（BiFC）、插入突变和RNA干扰等技术，发现STR2是丛枝发育所必需的，并通过与STR形成异二聚体参与脂质运输。接下来，以STR2在丛枝菌根真菌共生中的功能及其调控机制为起点展开研究，鉴定到ERF家族两个新的转录因子ERM1和ERF12拮抗调控营养交换基因表达和丛枝发育。酵母单杂（Y1H）和双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC）结果显示，ERM1直接与 STR2 和 STR 启动子中的AW-box和AW-box-like顺式元件结合，正调控菌根共生。Y1H、Dual-LUC和染色质免疫共沉淀联合荧光定量（ChIP-qPCR）实验表明 ERF12 能够 被ERM1/MtWRI5a直接激活，进而负调控菌根共生（图7）。AP2/ERF家族蛋白ERM1和WRI5a在菌根共生早期的营养交换中发挥正调控作用，而通过酵母双杂（Y2H）和BiFC实验，作者发现TOPLESS辅抑制因子TPR3a被ERF12招募来对抗MtERM1/MtWRI5a对菌根共生过程中营养交换的正调控作用，从而负调控菌根共生。

ERM1和WRI5a在菌根共生早期的营养交换中发挥正调控作用，并在共生末期受到调控以避免植物自身碳源的过度输出。 ERM1和WRI5a在共生末期适度激活 ERF12 的表达，ERF12作为桥梁蛋白，使ERM1/WRI5a与TOPLESS家族辅抑制因子能够建立联系，从而对脂质转运过程“踩下刹车”，防止植物自身营养的无效输出。此外，ERF12作为一个自我调节的转录因子，通过其AP2-DNA结合域和C端EAR基序介导对自身的转录抑制，以避免其对菌根共生进行持续或不恰当的抑制。这种“油门-刹车”反复进行的动态调控模式（图8），初步回答了植物在共生启动后如何保护自身营养不会过度输出的关键科学问题。

2024年1月，美国Boyce Thompson研究所Maria J. Harrison团队在 Science 杂志 上发表了题为“Receptor-associated kinases control the lipid provisioning program in plant-fungal symbiosis”的研究论文，该研究发现了两个皮层细胞特异性膜结合蛋白CKL1和CKL2，它们可以调节植物与丛枝菌根真菌共生中脂质的供应。

在该研究中，作者为了研究CKL1和CKL2的功能，首先分析了两个基因的表达模式并结合转录组数据，发现CKL2在AM共生体系中特异性表达，而CKL1的表达在非AM体系中也可以检测到。接着，作者利用CRISPR/Cas9技术创制了两个独立等位基因和双基因的突变体材料，通过检测AM真菌定殖的情况，作者发现突变体材料的根、茎生长均正常，但是相对于野生型突变体的真菌定殖能力有不同程度地下降，突变体上定殖的真菌出现了菌丝衰老和丛枝降解的现象。分析未受菌根定殖和受菌根定殖的 ckl 突变体植株的转录本，结果显示，CKL1和CKL2是AM共生过程中部分脂质的合成和供应所必须的（图9）。

作者通过亚细胞定位实验确定了CKL1主要定位在丛枝尖端周围的PAM上，而CKL2则均匀分布在PAM和整个质膜（PM）中。结构分析已知CKL蛋白缺乏跨膜结构域，但是存在肉豆蔻酰基化，实验证明肉豆蔻酰基化是CKL蛋白膜定位必需的。通过体外磷酸化实验，发现CKL蛋白的激酶活性也是其发挥功能所必需的，因此，作者认为CKL蛋白的激酶活性和膜定位功能是它们正常发挥功能所必需的。根据前面的实验数据，作者假设CKL蛋白可能参与了膜受体激酶的信号转导，通过体外激酶活性检测的数据分析，发现CKL蛋白是膜受体激酶。为了进一步探究CKL蛋白在受体类激酶膜信号转导中的作用，通过免疫共沉淀(Co-IP)和BiFC实验，结合磷酸化实验数据，证实了CKL蛋白是受体类蛋白激酶的底物的猜想。

LysM-RLK基因家族中 LYK9 突变后真菌定殖适度减少，而DMI2对真菌定殖也很重要， DMI2 突变会 导致的根内真菌生长变慢，这不是由于表面的共生关系受损，而是由于脂质的供应减少所导致的。进一步磷酸化位点的突变和回补等实验，确定了DMI2位于CKL蛋白的上游。综上，DMI2和LysM-RLKs对于真菌定殖植物根部是必须的。为了确定CKL蛋白的下游信号传导情况，作者重点研究了四类核心调控因子，包括钙调素依赖性蛋白激酶（DMI3）、DMI3的互作蛋白（IPD3）、转录调控因子RAM1和转录调控因子WRI5家族蛋白，它们共同调节许多细胞信号转导和脂质供应基因相关的转录活动，结果显示，同时过表达两个WRI5转录因子抑制了 ckl2 介导的共生表型。

综上所述，该研究发现了丛枝菌根共生过程中一个新的基因调控模块（图11）。即CKL蛋白通过在PM和PAM中的定位，将来自DMI2和LysM-RLKs的信号进行整合，激活了几种转录因子的功能，进而用于脂质的生物合成和输出。RAM2是脂质供应途径的核心组分，CKL信号传导很可能通过WRI5蛋白放大RAM1的调控功能，从而增加 RAM2 的表达。该研究揭示了菌根共生关系中脂质供应程序的两个不同但相关的基因调控模块，加深了我们对植物营养和生长调控过程的认识，具有重要的意义。

在农业中，AM真菌菌剂的应用可以减少化肥的使用，具有肥效持久、环境友好的特点，同时能够提高土壤有机质和养分含量及微生物数量，对提升作物品质有积极的影响；在盐碱地、矿山废弃地、重金属污染地生长的植物上接种AM真菌是一种新型的生物改良措施，AM真菌能够提高作物抗氧化酶活性，减缓植物的氧化损伤，缓解盐碱或矿物离子造成的细胞生理代谢紊乱，且真菌的分泌物还能起到改善盐碱地或矿物土壤结构，改良盐碱地的效果。

我国大力倡导建立资源节约型、环境友好型农业生产体系，因此，利用好植物和微生物之间的共生关系，对实现可持续农业和环境保护尤为重要。今天伯小远给大家介绍了AM真菌与植物共生的建立过程、AM共生的生态学价值、基因功能研究案例以及实际应用，下次有机会再给大家介绍根瘤菌和植物共生吧！