抗药物抗体(ADA)是蛋白药物成功临床应用的一个主要障碍，降低患者的治疗效果和安全性。预测抗体药物的免疫原性，对于临床试验顺利进展以及药物临床使用极其关键。
影响蛋白类药物免疫原性的因素，包括治疗性蛋白的内在和外在特性，患者相关因素(HLA单倍型、免疫状态)、治疗环境、药物递送方式和作用模式(MoA)等。
生物信息学评估
生物信息学主要用于预测药物氨基酸序列中潜在的
T细胞表位
。
系统扫描蛋白质的一级结构，计算可以与HLA结合的9-15mer表位并评分。在药物开发阶段，减少从苗头化合物（Hits）到候选药物（leads）数量，同时减少将来进入临床的候选药物的潜在T细胞表位，降低临床试验中ADA的发生。
单纯靠HLA亲和力进行预测，会大大高估T细胞表位数量，需要考虑更多的因素，如
影响9-15ʹmer氨基酸序列成为功能T细胞表位的因素：
-
HLA分子形成复合物的稳定性
-
APC对于表位的自然处理
-
序列-MHC-II槽特定的CD4+T细胞的存在
HLA结合序列不能成为T细胞表位的其他因素：
-
亲和力太低，无法引起免疫反应，
-
阴性选择已经清除了特定的T细胞，
-
Treg介导的外周耐受。
MHC洗脱肽结合质谱分析获得基础数据，再对算法系统进行教育，使其获得判断T细胞功能表位的能力。
有一些相关技术被开发：
-
MixMHC2pred
：集成了等位基因特异性基序，肽长度和结合核心偏移偏好，使用超过99000个独特的洗脱肽，进行
MoDec
分析（一个新的肽深度基序反褶积概率框架）。
-
MARIA
：基于多模态递归神经网络算法，包括肽序列、基于侧翼残基预测信息的切割分数和HLA结合分数，两者都来自新的预训练神经网络。Maria还包括基因表达水平，这是其特有的。
-
MAPTAC
：基于HLA-II等位基因纯化结合肽，通过LC/MS分析肽序列，预测肿瘤HLA-II结合肽。
Immunity
2019,
51
,
766–779
NNAlign_MAC 蛋白质药物（英夫利昔单抗）免疫肽谱分析
Front
Immunol. 2020;11:1304.
上述方法有特定的应用场景，且没有整合ADA的临床检测数据，因而不可以盲目使用。
免疫细胞功能实验
1. DC细胞成熟试验
可以激活DC等APC细胞，是预测生物药产生ADAs的指标之一。监测DC细胞成熟可以作为监测药物免疫原性的工具。
moDC可以通过几种方式生成。从人血液中分离PBMCs后，用磁珠分选单核细胞。加入
GM-CSF
和
IL-4
，诱导纯化单核细胞分化为不成熟moDCs。
使用生物药攻击moDCs，监测攻击后15分钟到48小时的
细胞参数
：
-
4-48小时，检测
细胞表面标记物
表达（至少包括CD83、CD80、CD86和CD40）
-
24-48小时，检测细胞培养上清
细胞因子分泌
（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF）
-
15-30分钟，参与DC成熟的
信号通路蛋白
的磷酸化，如Akt，ERK1/2和Syk，
-
早期（6-24小时）mRNA定量细胞因子和/趋化因子
对照组设定
对结果的评估取决于所使用的方法，通常涉及对至少10个捐赠者的统计分析。DC激活细胞表面标记物增加50%或100%。
2. T细胞功能试验
体外T细胞活化试验，试图通过测量CD4+T细胞对药物T细胞结合结构域的活化情况，评估治疗性蛋白和多肽的免疫原性风险。
T细胞功能检测通常由四个不同的成分和顺序步骤组成：1）抗原攻击、2）细胞培养成分和刺激、3）检测结果读出、4）数据分析
试验的关键点
1）抗原攻击
抗原剂量/浓度
对于记忆/回忆反应
单次攻击就足够了；攻击后24-72小时细胞因子读数，第7天的增殖读数。
对于初始反应
产生抗原特异性T细胞需多个连续抗原攻击；孵育时间可能在7到28天之间变化。
抗原作用模式
基于抗原性和靶点作用，细胞和检测形式将发生改变。
2） 细胞培养成分
-
培养基：RPMI, DMEM, Earle’s modified
-
血清：AB血清、自体血清、无血清
-
刺激抗原
-
细胞因子：IL-2, IL-6, IL-7, IL-12,IL-15, IL-17, IL-21（考虑：剂量、时间点、持续时间）
-
用于DC成熟的细胞因子：IL-4、GM-CSF和LPS，减少旁观者T细胞反应，并使用IFN-α减少背景
-
外源性刺激：LPS、TNF-α、IFN-α、CD40L、成熟鸡尾酒刺激未成熟树突状细胞
3）结果读取
ELISPOT 和 Fluorospot
：多重检测，根据细胞因子谱分析Th亚型。是短期记忆T细胞分析的理想选择，可以识别记忆T细胞的低频T细胞前体。
T细胞增殖
：
T细胞活化的标记物
；荧光标记物(如
CFSE
)；DNA增殖标记物和
Ki67
的细胞内染色；最适合延长刺激时间以产生初始T细胞反应。
使用
基于
流式细胞术
分析
：细胞
表面标记物如CD154（表明抗原特异性CD4T细胞活化）或细胞内细胞因子染色（作为T细胞活化
的标记物）
利用
Luminex®和MSD
等平台分泌细胞因子panel
3. B细胞功能分析
评估特定生物药品激活CD4+T细胞的潜力，它们激活B细胞，并诱导其分化为产生ADA的浆细胞。
B细胞表位
和产生生物药品特异性IgG的
B细胞数量
，是免疫原性风险的重要标准。然而，免疫原性风险评估中的B细胞成分目前被大大忽视了，主要受限于体外评估B细胞的技术。
B细胞表位
生物信息学预测方法已经被开发，如SEPIa，一种结合了13种不同序列衍生特征的算法，包括氨基酸组成、亲水性、溶剂可及性和主链灵活性。研究发现，SEPIa的性能优于基于序列和基于结构的现有方法，但与T细胞表位预测相比，仍然有局限。
产生特定IgG的B细胞数量
迄今为止，只有基于
ELISpot/FluoroSpot
的检测方法，被报道用于体外评估生物药品特异性IgG-B细胞。
它用PBMCs进行实验，报告分泌靶抗原特异性抗体的B细胞的数量。
该实验通过用激活鸡尾酒(通常至少包含一种TLRs激动剂和IL-2)启动B细胞，将记忆B细胞分化为浆细胞。
