如何在石蜡切片中获取免疫组化的芳心

有时候，实验看似容易，其实处处存在陷阱。稍微一不留意，就会掉入坑中而无法自拔。免疫组化，病理学实验的常用技术，看似容易，其实，做出一张漂亮的染色切片实属不易。

刚开始做免疫组化，我一味按照说明书及实验室的protocol来操作，做出来的切片不甚理想，经常获得不了预期的实验结果。以致于老板怀疑我的能力，我怀疑自己的人生。于是，我向各路大神请教，上网查各种帖子，甚至还专门查阅了免疫组化的发展简史，并结合自己的实践操作，不断改善自己的操作细节。

终于，我的组化技术有了很大的进步，做出了老板满意的切片，我也感到了从所未有的自信。趁工作空闲之时，我总结了一下我的经验，供各位与免疫组化奋战的童鞋借鉴参考。

千里之行始于足下，取材和标本处理是第一步，也是最为关键的一步。取材一定要按照相应规范取材，避开坏死组织（坏死组织易脱片）。固定液一般常用10%的中性甲醛和4%的多聚甲醛（当然也有其它类型的固定液），固定液的体积一般为10倍的组织体积（容器密封，多数固定液成分易挥发，否则固定效果不好，影响后续的实验）。

若为实质组织及含脂肪较多的组织，一定要切开固定并且延长固定时间（肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结及乳腺等），才能取得较好的固定效果。切片之前，一定要选择锋利刀片（切片之前可以将刀片在磨刀石上磨一磨），这样才能切出质量上乘的石蜡切片。

烤片一般问题不多，一般60℃烤两个半至三个小时就可以（若对于一些不稳定的分子，则需要适当缩短烤片时间，甚至可以用冰冻切片去做）。脱蜡需小心，脱蜡太过可导致组织脱片，脱蜡不足则可导致染色不佳。若是新的二甲苯，只需脱蜡2-3min，若为旧的二甲苯，则需脱蜡7-10min。

过氧化氢灭活至关重要，一般常用的浓度为0.3%-3%（用甲醇配置的过氧化氢效果好于双蒸水和PBS溶液配置的过氧化氢），浓度低（0.3%-1%）可灭活20min左右，浓度高（>1%）灭活10min左右。

过氧化氢要滴加于组织之上，不要浸泡，否则容易导致脱片。若遇见肝脏、肾脏、乳腺及甲状腺组织，适当延长灭活时间（这些组织中内源性过氧化氢酶含量较高）。修复液目前有EDTA、枸橼酸盐和胰蛋白酶溶液（可结合文献与说明书去选择），修复方法有煮沸、微波及高压修复，个人感觉，微波修复和高压修复效果较好。

高压修复时，一定在高压3min后冷却足够时间（一般30min左右），不要趁热捞出切片，否则EDTA、枸橼酸盐结晶析出粘在切片上，导致染色效果不佳。修复时将切片放入修复液时应操作柔和，否则容易脱片。

（一般用EDTA修复时容易发生脱片，癌组织、乳腺、甲状腺及脑组织容易发生脱片，这些情况下操作一定要轻柔！个人的悲惨教训，修复完毕，组织不翼而飞！遇到这些组织，一定操作轻柔，同时选用多聚赖氨酸包被的载玻片）

每一步用PBS冲洗时也要操作轻柔，否则容易把组织冲走！

封闭一般选择血清（一般牛血清、羊血清常见），用BSA也可以。抗体孵育时一抗4℃过夜或者37℃2小时（个人认为，4℃过夜的效果较好，切片从4℃环境中取出应先复温30min，否则容易出现脱片！），二抗37℃孵育10-20min。在孵育及染色的全过程中，切片一定要保持湿润，不要出现干片，否则会出现非特异染色。

DAB染色为关键之步，必须要在显微镜下观察显色情况，稍微发黄便终止染色。苏木素染色的前一天要用滤纸过滤苏木素除去渣滓，保证切片背景的干净。苏木素染色结束后，最好在镜下观察染色深浅，苏木素的颜色程度不能超过DAB的颜色程度（若苏木素染色合适，则无需过盐酸分化液；若颜色过重可以在盐酸分化液中浸润几秒）。

返蓝液有0.1%氨水和50℃温水返蓝（个人认为，氨水返蓝效率高）。酒精梯度脱水液要时常更换（一般一个月换一次，否则脱水效果不好，会影响后续切片的观察与图像的采集），二甲苯透明一般只需几秒即可。

最后，祝大家实验顺利，早发文章！