如何在石蜡切片中获取免疫组化的芳心

有时候，实验看似容易，其实处处存在陷阱。稍微一不留意，就会掉入坑中而无法自拔。免疫组化，病理学实验的常用技术，看似容易，其实，做出一张漂亮的染色切片实属不易。

刚开始做免疫组化，我一味按照说明书及实验室的protocol来操作，做出来的切片不甚理想，经常获得不了预期的实验结果。以致于老板怀疑我的能力，我怀疑自己的人生。于是，我向各路大神请教，上网查各种帖子，甚至还专门查阅了免疫组化的发展简史，并结合自己的实践操作，不断改善自己的操作细节。

终于，我的组化技术有了很大的进步，做出了老板满意的切片，我也感到了从所未有的自信。趁工作空闲之时，我总结了一下我的经验，供各位与免疫组化奋战的童鞋借鉴参考。

千里之行始于足下，取材和标本处理是第一步，也是最为关键的一步。取材一定要按照相应规范取材，避开坏死组织（坏死组织易脱片）。固定液一般常用10%的中性甲醛和4%的多聚甲醛（当然也有其它类型的固定液），固定液的体积一般为10倍的组织体积（容器密封，多数固定液成分易挥发，否则固定效果不好，影响后续的实验）。

若为实质组织及含脂肪较多的组织，一定要切开固定并且延长固定时间（肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结及乳腺等），才能取得较好的固定效果。切片之前，一定要选择锋利刀片（切片之前可以将刀片在磨刀石上磨一磨），这样才能切出质量上乘的石蜡切片。

烤片一般问题不多，一般60℃烤两个半至三个小时就可以（若对于一些不稳定的分子，则需要适当缩短烤片时间，甚至可以用冰冻切片去做）。脱蜡需小心，脱蜡太过可导致组织脱片，脱蜡不足则可导致染色不佳。若是新的二甲苯，只需脱蜡2-3min，若为旧的二甲苯，则需脱蜡7-10min。

过氧化氢灭活至关重要，一般常用的浓度为0.3%-3%（用甲醇配置的过氧化氢效果好于双蒸水和PBS溶液配置的过氧化氢），浓度低（0.3%-1%）可灭活20min左右，浓度高（>1%）灭活10min左右。

过氧化氢要滴加于组织之上，不要浸泡，否则容易导致脱片。若遇见肝脏、肾脏、乳腺及甲状腺组织，适当延长灭活时间（这些组织中内源性过氧化氢酶含量较高）。修复液目前有EDTA、枸橼酸盐和胰蛋白酶溶液（可结合文献与说明书去选择），修复方法有煮沸、微波及高压修复，个人感觉，微波修复和高压修复效果较好。

高压修复时，一定在高压3min后冷却足够时间（一般30min左右），不要趁热捞出切片，否则EDTA、枸橼酸盐结晶析出粘在切片上，导致染色效果不佳。修复时将切片放入修复液时应操作柔和，否则容易脱片。

（一般用EDTA修复时容易发生脱片，癌组织、乳腺、甲状腺及脑组织容易发生脱片，这些情况下操作一定要轻柔！个人的悲惨教训，修复完毕，组织不翼而飞！遇到这些组织，一定操作轻柔，同时选用多聚赖氨酸包被的载玻片）

每一步用PBS冲洗时也要操作轻柔，否则容易把组织冲走！