Plus深读 | RNA甲基化和甲基化转移酶介导白血病染色体组装和5-AZA响应及抗性

原文链接：

http://www.nature.com/articles/s41467-018-03513-4

迄今为止，已鉴定的RNA修饰有110种 ¹ ，RNA N ⁶ -甲基腺苷（RNA:m ⁶ A）是众多研究的热点。然而，大多数的RNA修饰及其修饰酶在基因调控和染色体组装中的作用仍未被探索 ² ，RNA 5-甲基胞嘧啶（RNA:m ⁵ C）及其修饰酶很少引起关注。目前，在人类中发现57种RNA甲基转移酶 ³ ，其中，至少有十个RNA:m ⁵ C 甲基转移酶（RNA:m ⁵ C methyltransferases，RCMTs），包括NSUN1~NSUN7，NSUN5a/b/c和DNMT2。RBPs（RNA-binding proteins，RBPs）在基因调控和染色体组装中起着关键的作用，其中，hnRNPK是进化保守的核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族成员之一，能结合pre-mRNA并且影响其剪接、转运和翻译 ⁴ ，其异常表达常与肿瘤相关。5-AZA是一种DNA甲基化抑制剂，被广泛用于治疗不同的血液肿瘤，例如，骨髓发育异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和急性骨髓性白血病（acute myeloid leukaemia，AML）。在白血病中，大多数（~90%）AZA嵌入RNA ⁵ ，然而， RNA:m5C、RCMTs 和hnRNPK是否在白血病细胞中对5-AZA的响应/抗性中起重要作用尚不清楚，本文在5-AZA敏感性白血病细胞（5-AZA-sensitive leukaemia cells ，ASLCs）和5-AZA抗性白血病细胞（5-AZA-resistant leukaemia cells ，ARLCs）中探讨了这个问题。

一、材料和方法

1，  主要细胞系

（1）ASLCs：OCI-M2和SC细胞系；

（2）ARLCs：M2AR和SCAR细胞系。

上述细胞系是研究者使用不同表观药物从十株细胞系中筛选出来的。

2，  主要方法

（1）Western Blot；

（2）免疫测定（immunoassay） ⁶ ：基于免疫亲和结合(抗体与抗原的结合)原理对特定的生化物质所进行的定性或定量分析；

（3）染色质免疫共沉淀实验（chromatin immunoprecipitation assay， ChIP）：用于定量分析基因组特定位点RNA聚合酶II的招募；

（4）交联辅助DNA修饰免疫沉淀实验（Crosslink-assistant DNA modification immunoprecipitation assay） ⁷ ：用于定量分析特定基因组5-mC和5-hmC修饰水平；

（5）染色体构象俘获技术（chromosome conformation capture ，3C） ⁸ ：用于分析不同染色体结构间是否存在相互作用；

（6）PL-RCA（proximity ligation and rolling cycle amplification，PL-RCA）：用于分析RNA聚合酶II、RCMTs、hnRNPK和BRD4的共定位；

（7）EU核酸标记技术在体分析新生RNA ⁹ ：在细胞水平可视化和定量分析新生RNA。

二、实验结果

1，RNA:m5C、RCMTs和hnRNPK在ARLCs中水平增加

图1. RNA:m5C、RCMTs和hnRNPK在ARLCs和ASLCs中表达及hnRNPK结合效率

如图1a，与ASLCs细胞系OCI-M2和SC相比，M2AR和SCAR细胞系中NSUN1/2/3、DNMT2和hnRNPK显著增加（~3倍），有意思的是，他们的增加促进了RNA:m5C形成但不影响DNA:m5C水平（图1b和1c）。纯化重组的hnRNPK蛋白，FAM分别标记poly（C）RNA和poly（m ⁵ C）RNA，体外结合实验发现，hnRNPK更易结合发生m5C修饰的RNA（如图1d和1e）。这些结果提示 RNA:m5C、RCMTs和hnRNPK可能参与白血病细胞中对5-AZA的响应/抗性。

2，白血病细胞中不同功能RCMT复合体

如图2a，在OCI-M2细胞中，使用不同浓度RNase消化后进行免疫共沉淀，hnRNPK直接与DNMT2和NUSN3相互作用而不依赖与RNA。为进一步研究hnRNPK和RCMTs的功能，研究者进行了一系列RNAi干扰实验，在SC细胞中分别敲减hnRNPK、DNMT2、NSUN1/2/3，Western blot检测发现，敲减hnRNPK、DNMT2和NSUN3后，不仅降低靶蛋白表达而且显著减少三个蛋白中其他蛋白（如图2b）， 这暗示hnRNPK、DNMT2和NSUN3很可能形成功能复合体 ；此外，敲减hnRNPK轻微降低SPI1/PU.1表达，但不影响总的RNA聚合酶II表达；敲减NSUN1和NSUN2后，抑制两者中其他蛋白表达，但并不影响hnRNPK、DNMT2和NSUN3表达（如图2c）。MTT实验发现，分别敲减hnRNPK、DNMT2、NSUN1/2/3都能显著抑制SC细胞生长（如图2d），这提示上述蛋白是白血病细胞生长所必须的。由此推断， 在白血病细胞中，hnRNPK与不同的RCMTs形成不同的功能复合体对于其稳定性和细胞生存至关重要。

图2. 白血病细胞生存所需的不同功能的hnRNPK/RCMT复合体

3，  5-AZA诱导细胞系相关的染色体改变

图3 白血病细胞中细胞系相关的药物响应染色体结构改变

为研究5-AZA对染色体结构的影响，研究者分析了细胞系特定转录因子（transcription factors，TFs），GATA1和SPI1/PUC.1以及TET2在细胞中的亚细胞定位及共定位，在OCI-M2中，GATA1和TET2共定位形成点样染色体结构，5-AZA处理后破坏这种结构（如图3a）；在SC细胞系中，具有相似的模式，即SPI1/PUC.1和TET2共定位形成点样染色体结构，5-AZA处理后破坏改结构（如图3b）。如图3c所示，与SC细胞系相比，OCI-M2对AZA处理更加敏感，在1μM AZA处理后基本不生长。染色体构象俘获技术发现在OCI-M2和K562细胞系中，SPI1/PUC.1基因中1L和4R配对引物检测几乎没有PCR信号，但5-AZA处理后有高水平的PCR信号（图3e左），暗示 5-AZA处理导致增强子与启动子的相互作用 ；相反，在SC和THP1细胞系中，SPI1/PUC.1基因中1L和4R配对引物检测有高水平的PCR信号，而5-AZA处理后显著降低PCR信号（图3e右），这表明不同类型的白血病对5-AZA的响应是不同的。进一步的ChIP实验证明，AZA处理后，OCI-M2和K562细胞中SPI1/PUC.1启动子和增强子处RNA聚合酶II显著增加，而SC和THP1细胞中是相反的（如图3f）。这些结果提示，在OCI-M2和K562细胞中，AZA处理形成非环装结构的失活的染色质结构，减少RNA聚合酶II在启动子的富集，而在SC和THP1细胞中，AZA处理形成环的激活的染色质结构，促进增强子和启动子的相互作用，增加RNA聚合酶II在启动子的聚集，促进基因转录（图3g），这暗示在 白血病细胞中，5-AZA可诱导细胞系相关的特定基因染色体结构改变。

4，RNA/hnRNPK介导TF-染色体修饰蛋白相互作用

为阐明细胞系相关的5-AZA响应的染色体结构变化，研究者通过Western blot、IP和Co-IP检测细胞系特定转录因子GATA1和SPI1/PUC.1以及不同染色体修饰蛋白TET1/2/3、DNMT1、DNM73A/3B和EZH1/2的表达和相互作用。

在OCI-M2和SC细胞中，TET1/2/3、DNMT1、DNM73A/3B和EZH1/2表达水平差不多（图4a，input），GATA1在OCI-M2中高表达，在SC中几乎不表达，而SPI1/PUC.1在OCI-M2低表达，在SC中高表达。如图4a，在OCI-M2中，GATA1与TET2和DNMT3A/B相互作用，SPI1/PUC.1与DNMT1和EZH2相互作用；在SC中，SPI1/PUC.1选择性结合TET2，与DNMT3A/B并不相互作用。如图4b和4c，在OCI-M2细胞中，加入5-AZA 30分钟后， SPI1/PUC.1与DNMT1的相互作用迅速减弱；在SC细胞中，加入5-AZA 10分钟后，SPI1/PUC.1与TET2的相互作用基本没有了，这意味着5-AZA能迅速破坏TFs与染色体修饰蛋白的相互作用。如图4d，在OCI-M2细胞中，RNase破坏GATA1-TET2和SPI1/PUC.1-DNMT1之间的相互作用，但不影响SPI1/PUC.1-EZH2之间的相互作用；如图4e，在SC细胞中，SPI1/PUC.1-TET2相互作用对RNase消化很敏感，这些结果提示， RNA介导TET2与GATA1或者SPI1/PUC.1的相互作用。 然而，在生理情况下，并不能有效检测TET2或GATA1和SPI1/PUC.1结合的RNA。因此，研究者筛选商业化hnRNP家族蛋白抗体作为诱饵确定相互作用的RNPs。如图4f，在OCI-M2细胞中，只有hnRNPK与GATA1和TET2相互作用。这些结果提示，在白血病细胞中，RNA/hnRNPK介导细胞系特定TFs和染色体修饰蛋白间5-AZA 敏感性相互作用（如图4g）。

5，  hnRNPK结合CDK9形成5-AZA敏感型激活染色质

CDK7/TFIIH和CDK9/P-TEFb能分别磷酸化RNA聚合酶的C端结构域（C-terminal domain，CTD）第5位和第2位的丝氨酸，即CTD-S5P、CTD-S2P，分别促进转录起始和延伸 ^10,11 。Western blot显示在OCI-M2细胞中，在5-AZA处理1.5h后， CTD-S2P显著减少，而总的RNA聚合酶、RCMTs、hnRNPK 、CDK9/P-TEFb和CDK7基本不变化（如图5a）。Rnase消化偶联IP和co-IP揭示在OCI-M2细胞中，hnRNPK和CDK9/P-TEFb间存在直接相互作用，而与CTD-S2P和CDK7//TFIIH间存在间接相互作用（如图5b）。结合最近研发的5-EU核酸标记技术和激光共聚焦荧光显微镜，研究者在体证明hnRNPK和激活的RNA聚合酶（CTD-S2P）共定位在新生的RNA，而且与5-AZA敏感性OCI-M2细胞和相比，5-AZA抗性M2AR细胞中这种共定位显著增加（如图5c）。

图4. RNA/hnRNPK介导不同细胞系特异TFs和染色体修饰蛋白的相互作用

此外，在OCI-M2细胞中，5-AZA迅速破坏hnRNPK与CTD-S2P/CDK9/7的相互作用（如图5d），但是5-AZA并不影响hnRNPK与DNMT2和NSUN3的相互作用（如图5e）。基于上述结果，研究者提出了一个模型（如图5f）：在白血病细胞中， 在新生RNA附近，hnRNPK/RCMT介导5-AZA敏感的染色体结构激活。

6，  在ARLCs中NSUN1/BRD4直接结合RNA聚合酶II CTD-S2P

为探索RNA聚合酶II和RCMT复合体在5-AZA抗性细胞中的作用，研究者比较了上述蛋白在ASLCs和ARLCs中表达情况。Western blot显示， 与5-AZA敏感细胞系OCI-M2和SC 相比，总的RNA聚合酶II、CTD-S2P、CDK7、CDK9/P-TEFb、BRD4和BRD2 在5-AZA抗性细胞系M2AR和SCAR 中轻微增加（如图6a）。与预期结果一致，与ASLCs相比，hnRNPK相关的CTD-S2P在M2AR细胞中显著增加（如图6b）。意外的是，hnRNPK与CTD-S2P和GATA1增加的相互作用对5-AZA更加敏感，在5-AZA处理20分钟后，它们之间的相互作用就被破坏了（如图6b），这暗示 对于5-AZA抗性，存在一个非hnRNPK依赖性机制。 这便引导研究者在ARLCs中寻找介导RNMTs和CTD-S2P相互作用的因子。如图6c，CTD-S2P-NSUN1相互作用仅存在于M2AR细胞，且对5-AZA不敏感，相反，CTD-S2P与DNMT2和NSUN3相互作用在M2AR细胞中对5-AZA很敏感。

图5. 5-AZA破坏激活的RNA聚合酶II和hnRNPK/RCMT复合体

此外，如图6d，与OCI-M2细胞相比，BRD4相关的CTD-S2P在M2AR细胞中显著增加，而BRD4相关的CDK9/P-TEFb在M2AR细胞中基本无变化，BRD4与NSUN1的相互作用仅存在于M2AR细胞中。这些结果揭示NSUN1/BRD4/CTD-S2P是ARLCs中特有的复合体，暗示在 白血病细胞中NSUN1/BRD4介导5-AZA抗性。

图6. 在ASLCs中确定CTD-S2P与NSUN1和BRD4的相互作用

7，  在ARLCs中存在不同的NSUN1/BRD4相关的活性染色质

图7. 在ARLCs中在不同的NSUN1/BRD4相关的染色体结构

如图7a和7b，NSUN1、BRD4和CTD-S2P在OCI-M2细胞和M2AR细胞中与新生RNA都存在共定位，然而，在OCI-M2细胞中，NSUN1、BRD4和CTD-S2P与新生RNA的共定位是跟分散，相反，在M2AR细胞中，这些共定位形成不同核周围颗粒。PL-RCA实验进一步确定，与OCI-M2细胞相比，NSUN1和BRD4与CTD-S2P在M2AR细胞中具有更强的信号。这些结果证明 在ARLCs中存在不同的NSUN1/BRD4相关的活性染色体结构。

8，  靶向NSUN1/BRD4偏好抑制ARLCs细胞生长

图8. CDK7/9 和BRD4的抑制剂以及RSMT siRNAs对ASLCs和ARLCs细胞生长作用

基于以上研究，研究者猜测ASLCs和ARLCs对靶向CTD激酶和RCMTs的抑制剂和siRNAs有不同的响应，分别使用BS-181和PHA-767491抑制CTD激酶活性、CDK7/9激酶活性，JQ1抑制BRD4。如图8a，与M2AR细胞相比，BS-181和PHA-767491对OCI-M2细胞生长抑制作用更强；然而，JQ1偏好抑制M2AR细胞生长（如图8b）。如图8c，敲减hnRNPK、NSUN3、NSUN2和DNMT2偏好抑制OCI-M2细胞生长，而敲减NSUN1偏好抑制M2AR细胞生长，此外，在5-AZA抗性细胞系SCAR中敲减NSUN1后，该细胞对5-AZA敏感。因此， 在5-AZA抗性细胞中，NSUN1/BRD4复合体对于5-AZA抗性起着关键作用。

9，mRNA:m5C在5-AZA抗性的临床AML/MDS细胞中显著增加

为进一步确定临床上AML/MDS中5-AZA抗性细胞中mRNA:m5C的临床特点，研究者收集了18例临床的AML/MDS病人细胞，其中9例是5-AZA抗性的病人，9例是5-AZA敏感性的病人。如图9a，质谱能够有效分辨mRNA:m5C和mRNA:A的峰，而且在典型的AZA抗性AML患者细胞中，m ⁵ C/A显著增加，这与定量分析不同临床样本中m ⁵ C/A比率是一致的，即m ⁵ C/A在5-AZA抗性AML/MDS患者细胞中显著增加（如图9b），在标准化后，这种差异更加显著（如图9c）。质谱结果暗示 在AML/MSD中，mRNA:m5C对于介导5-AZA抗性起着重要的作用。

图9. 质谱分析临床5-AZA敏感/抗性的MDS/AML样本中mRNA:m5C水平

10， 在临床标本中存在与NSUN1/BRD4相关的活性染色质

研究者使用PL-RCA分析了5-AZA敏感性/抗性的AML/MDS中NSUN1、BRD4和CTD-S2P中的表达和共定位情况，如图10a和10b，与5-AZA敏感性AML病人细胞相比，NSUN1/CTD-S2P和BRD4/CTD-S2P在5-AZA抗性AML病人细胞中具有更强的共定位。由于临床样本中细胞数目有限，研究者不能实施进行co-IP和EU核酸标记实验，但通过形态学、免疫组化等分别检测了源自于正常对照组和多系发育异常（multilineage dysplasia，RCMD）亚型及AML病人组细胞中hnRNPK、NSUN1和BRD4的表达和亚细胞定位情况。如图10c，与正常组相比，hnRNPK、NSUN1和BRD4在MDS/RCMD和AML中显著增加，且它们的增加与MDS/AML病程相关；如图10d，与正常组相比，hnRNPK和CTD-S2P共定位在AML中显著增加。这些数据提示，在临床上，hnRNPK、NSUN1和BRD4的表达水平与MDS/AML病程相关，且参与调控5-AZA抗性和疾病发展。

最后，研究者对OCI-M2和M2AR、SC和SCAR细胞系进行了测序，特别分析了表观调控因子、DNA和RNA修饰蛋白相关的基因突变，与OCI-M2细胞相比，16个RNA修饰蛋白基因是M2AR细胞特异的；相似的是，与SC细胞相比，15个RNA修饰蛋白基因是SCAR细胞特异的，这些基因的发现将有助于进一步揭开白血病中5-AZA抗性的机制。

三、总结与展望

DNA甲基化抑制剂已经广泛应用于治疗不同的血行性和非血行性恶性肿瘤。然而，越来越多的证据发现DNA甲基化状态与DNA甲基化抑制剂的临床响应并不相关 ¹² 。该研究探讨了DNA甲基化抑制剂5-AZA在白血病细胞中5-AZA敏感性/抗性中的机制，即：

1，  hnRNPK直接与DNMT2和NSUN3结合形成功能性复合体，对于维持这些蛋白的稳定性和白血病细胞生存是至关重要的；

2，  在ASLCs中，hnRNPK直接与NSUN3、DNMT2和CDK9/P-TEFb相互作用招募RNA聚合酶II，形成5-AZA敏感性的活性染色体结构；

3，  在ARLCs中，NUSN1与BRD4和RNA聚合酶II（CTD-S2P）相互作用形成活性染色体结构，促进转录，是5-AZA抗性的关键蛋白；

4，  在临床上，hnRNPK、NSUN1和BRD4的表达水平与白血病病程相关，且参与5-AZA抗性和疾病发展。

图10. 在5-AZA抗性AML/MDS中hnRNPK NSUN1和BRD4与CTD-S2P的表达

该研究首次在白血病细胞中发现RCMTs/hnRNPK介导的细胞系相关药物响应的染色体结构变化 ，另外一个重要的发现就是 在ARLCs的新生RNA附近，存在5-AZA抗性相关的RNA聚合酶II（CTD-S2P）与NSUN1和BRD4相互作用形成的不同活性染色体结构。 然而，在白血病细胞中，参与RCMTs相关的药物敏感性/抗性的基因和化学修饰仍需要深入研究，以期寻找疾病诊断的生物标志物和有效的治疗靶标。

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