维生素E的生物合成及生产研究进展

维生素E是一种重要的脂溶性维生素，由生育酚和生育三烯酚组成，具有抗氧化、抗炎和调节脂质等多种生理功能，已广泛应用于食品工业、化妆品、膳食补充剂、药品和动物营养等多个领域。目前，维生素E的生产主要依赖于植物提取和化学合成，合成生物学和生物技术工具的发展则为生产天然维生素E开辟了新途径。

近日，浙江大学叶丽丹研究团队于期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry发表研究综述Evolution of Vitamin E Production: From Chemical Synthesis and Plant Extraction to Microbial Cell Factories，系统总结了维生素E生产的研究进展，特别是工程植物及微生物细胞工厂中维生素E的生物合成进展，为促进维生素E的可持续绿色生产提供了参考。

从自然资源中提取

天然维生素E主要富集在植物油中，通常从植物油和油籽作物的脱臭蒸馏残渣中提取。研究已开发出多种提取天然维生素E的方法，包括皂化-提取法、溶剂提取法和超临界流体提取法。一种常见的提取方法涉及用低级醇酯化脱臭蒸馏残渣中的脂肪酸，然后通过中和和冷却结晶得到浓缩的天然维生素E产品，同时保持其生物活性。然而，基于植物的提取方法面临高成本、气候依赖、复杂的纯化过程和对生物多样性的潜在影响等挑战，这些因素使得植物提取方法难以持续满足市场需求。

化学合成α-生育酚

化学合成维生素E占全球维生素E产量的80%以上，主要用于动物饲料。1938年，首次成功使用“一步缩合”方法化学合成α-生育酚，该过程涉及在酸性催化下将2,3,5-三甲基氢醌（TMHQ）作为主环结构与异植物醇（IP）作为侧链进行缩合。这一方法经过多年的改进，目前的产量已超过95%。为了满足对维生素E日益增长的需求，研究人员开发并优化了各种合成其前体的方法。

图1 | 维生素E的化学合成

TMHQ的工业合成路线可分为几种不同方法，分别以对二甲苯、巴豆醛、4-叔丁基苯酚、甲酚、异佛尔酮、苯酚和1,2,4-三甲基苯为起始材料。IP的制备主要遵循两条路线，基于关键中间体：伪离子酮法和薰衣草醇法。尽管维生素E的化学合成提供了显著的优势，并在原料工业中占有重要地位，但IP的合成仍然是一个挑战。该过程需要七个催化步骤，包括在高压下进行的多步炔烃反应，这需要复杂的设备和严格的安全措施。

生物基法尼烯作为中间体半合成α-生育酚

2014年，武汉大学药学院刘天罡研究团队创新提出了一种结合了生物合成和化学合成的半合成维生素E生产方法，该过程利用微生物发酵生产法尼烯作为合成IP的中间体，进而用于合成α-生育酚。研究人员通过工程大肠杆菌中的关键酶创建了一个能够有效合成法尼烯的菌株。通过目标工程，法尼烯的生产可以系统地提高到1.1g/L的摇瓶规模。在此基础上，2022年，该团队采用酿酒酵母作为宿主生物体，通过蛋白质工程和系统的代谢工程策略，显著提高了法尼烯的生产，达到了55.4g/L。

图2 | 维生素E的半合成

使用生物合成的法尼烯作为前体，可以在仅三步中完成植物醇的合成，减少了对潜在危险材料的需求。然而，需要注意的是，这种维生素E合成方法的最后阶段仍然依赖于化学方法。这种半合成路线的一个限制，与传统使用TMHQ和IP的化学合成类似，是无法生产立体化学纯化合物，而是产生α-生育酚的外消旋混合物，其生物活性可能低于天然形式。

维生素 E的生物合成研究进展

尽管化学合成和半合成α-生育酚的方法已经建立，但这些方法在生产维生素E的具体立体异构体方面存在不足，而这些立体异构体对其生物活性至关重要。此外，由于对化学残留的担忧，合成维生素E的应用主要限于动物饲料添加剂。

在健康、制药和化妆品行业中，对天然合成维生素E的偏好日益增长。在各种形式中，生育三烯酚因其比生育酚更优越的抗氧化和抗炎特性而受到显著关注。为了满足日益增长的需求，研究正越来越多地专注于通过植物遗传改良或通过合成生物学方法将模式微生物转化为维生素E细胞工厂，以提高天然生物合成维生素E的产量。

维生素E的生物合成途径

阿拉伯芥和藻类中维生素E的合成途径早已阐明，这条途径在藻类和植物之间高度保守，需要两个关键前体：高香草酸（HGA）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）。HGA通过莽草酸途径产生，这条途径涉及多个步骤，包括PEP和E4P的缩合生成莽草酸，莽草酸转化为预苯酸，再转化为络氨酸、4-HPP，最后由4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（HPPD）催化，将4-HPP氧化为HGA。GGPP主要通过质体中的MEP途径合成，MEP途径以G3P和丙酮酸的缩合开始，在DXP合酶（DXS）的催化下产生1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），经过几个步骤后，形成IPP和DMAPP，然后缩合形成GGPP。

图3 | 维生素E在光合植物中的生物合成途径

对于生育三烯酚，HGA和GGPP在高香草酸香叶基转移酶（HGGT）的催化下发生缩合反应，形成2-甲基-6-香叶基苯并喹啉醇（MGGBQ）；对于生育酚，GGPP首先被香叶基香叶基二磷酸还原酶（GGDR）还原为植物醇二磷酸（PDP），然后PDP与HGA缩合，由高香草酸植物醇转移酶（HPT）催化，生成2-甲基-6-植物醇苯并喹啉醇（MPBQ）。

这些中间体（MGGBQ和MPBQ）可以进一步被甲基转移酶转化为2,3-二甲基-5-香叶基苯并喹啉醇（DMGGBQ）和2,3-二甲基-5-植物醇苯并喹啉醇（DMPBQ），然后由生育酚环化酶（TC）催化，产生δ和γ形式的生育三烯酚和生育酚。最后，γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）将这些形式转化为其各自的β和α异构体。

提高植物维生素E产量的代谢工程

在阐明维生素E生物合成基因后，研究采用了多种策略来提高植物中的维生素E水平。一种常见的方法是通过代谢工程增强HGA和GGPP或PDP等关键中间体的供应，例如在植物中过表达酵母源PDH已被证明可以增加4-HPP的供应，从而增强HGA及其衍生化合物的生产；通过解除酪氨酸对莽草酸途径中ARO3/ARO4活性的反馈抑制，可以增加莽草酸的供应；调整PEP和E4P之间的比例或优化它们的合成途径也可以增强莽草酸途径中的碳通量等。

此外，过表达直接参与维生素E合成的基因也被证明是有效的，例如在大豆和玉米种子中增加HGGT的表达显著增加了维生素E的含量，与野生型品种相比，大豆种子中的总生育三烯酚水平增加了高达15倍；综合方法也显示出应用前景，通过结合RNAi介导的叶绿素合成酶抑制与HPT和TyrC的过表达，阿拉伯芥种子中的生育酚含量增加了近3倍，同时轻微积累了生育三烯酚。此外，HPPD的过表达已被证明可以增加生育三烯酚与生育酚的比例。

维生素E生物合成的微生物细胞工厂的开发

计算机辅助建模、系统生物学、合成生物学和蛋白质工程的进步，使得设计和构建复杂植物天然产物的人工合成途径成为可能，包括在微生物细胞工厂中生物合成生育三烯酚。

大肠杆菌中的δ-生育三烯酚合成

在大肠杆菌通过过表达PpHPPD、PaCrtE、SyHPT和AtVTE1首次实现了δ-生育三烯酚的异源合成，产量为15μg/g DCW。后续研究通过将这些基因整合入大肠杆菌基因组，解决了多拷贝质粒带来的代谢负担问题，并通过基因组整合IDI和DXS进一步增强MEP途径，使MGGBQ（生育三烯酚的前体）积累量增加至1425μg/g DCW。

酿酒酵母中的生育三烯酚合成

酿酒酵母因其能够表达复杂蛋白质、进行翻译后修饰，并适应工业条件而成为生产高价值植物源天然产物的首选。通过引入和过表达外源HPPD、HGGT、TC、MPBQ-MT和γ-TMT等酶，结合内源的莽草酸途径和MVA途径，已成功实现在酿酒酵母中合成生育三烯酚。通过整合PpHPPD、SyHGT和AtVTE1，并过表达tHMG1和GGPPSsa增强GGPP供应，研究成功构建了产生4.10 mg/Lδ-生育三烯酚的酵母菌株；同年，研究小组开发了一株能够产生所有四种生育三烯酚的酵母菌株，通过整合密码子优化的基因，摇瓶培养中总生育三烯酚产量达到313μg/g DCW；通过增强前体供应和关键酶的过表达，总生育三烯酚产量可达2.6 mg/g DCW；通过温度控制和动态表达调控合成途径基因，实现了高密度发酵生产生育三烯酚，产量高达320 mg/L，为迄今报道的最高产量。

维生素E的需求因其健康益处而增长。传统生产依赖化学合成和植物提取，新兴方法包括半合成和从头生物合成。自然提取生物活性高但产量低，化学合成成本低但环境污染大，半合成和从头生物合成更可持续。通过代谢工程，已在酿酒酵母中实现生育三烯酚生产，但产量未达工业标准。未来研究需改进微生物底盘、酶功能和路径分隔，以提高产量和耐受性，满足市场对可持续维生素E的需求，同时减少环境影响。