来源：丁香学术
人类基因组计划由美国科学家于 1985 年率先提出，1990 年正式启动，并于 2001 年发表人类基因组工作草图，而人类基因组学研究的一个基本挑战是明确其中 30 亿个碱基对对于基因调控和蛋白质功能的影响。
要想达到这个目的，需要开发高效的工具以靶向诱导基因突变，从而揭示序列结构关系、功能获得和功能丧失等，特别是针对单个基因组位点的精准靶向编辑。近年来，尽管系列基因编辑工具被开发，如 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，但目前仍没有一种方法可以在哺乳动物细胞内源性基因组的目标区域进行编辑和诱变。
近日，麻省理工学院/哈佛大学布罗德研究所和哈佛大学丹娜法博癌症研究中心的 Fei Chen 和 Bradley E. Bernstein 团队在 Science 杂志发表研究论文「Helicase-assisted continuous editing for programmable mutagenesis of endogenous genomes」（图 1），该研究报道了他们最新开发的对哺乳动物细胞内源性基因组进行靶向诱变的技术--解旋酶介导的连续突变技术（Helicaseassisted continuous editing, HACE），HACE 使用 CRISPR-Cas9 来指导解旋酶脱氨酶融合的加载，以实现下游基因组序列的靶向编辑。随后，他们应用 HACE 对编码和非编码基因组元件进行功能表征。总的来说，HACE 为编辑基因和调控区域的靶向突变提供了一种新的策略。此外，HACE 的长编辑范围也可以揭示基因座上多个远距突变之间的组合效应和相互作用。
图 1 相关研究（图源：[1]）
HACE 的设计理念与实现
鉴于解旋酶可以穿越大的基因组区域，并可解旋基因组中单链 DNA（ssDNA）区域，因此研究人员认为这些解旋酶可以用于内源性基因组的诱变。为了验证这一点，他们构建了 HACE 编辑器（HE）蛋白，并在 HE 的 3' 端添加了尿嘧啶 DNA 糖基酶抑制剂（Uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI），该抑制剂已被证明可促进 C:G>T: A 突变。为了将 HE 靶向到所需的位点，他们使用了 nCas9 变体和相应的单导 RNA（sgRNA）。随后，他们将分别表达 HE、nCas9 和靶向 HEK3 位点的 sgRNA 的质粒共转染到 HEK293FT 细胞系中，并通过扩增子测序评估编辑率。结果表明，在 HE、nCas9 和 sgRNA 存在的情况下，靶向区域发生了编辑，但在仅转染 HE 或仅转染 nCas9 和 sgRNA 的细胞中，并没有观察到突变水平升高（图 2），这表明基因编辑是由 HE 驱动的，并且编辑依赖于 sgRNA 和 nCas9。
同时，他们还发现 HACE 可以在遥远的基因组位点之间偶联超突变，从而实现多路复用或遗传相互作用的评估。此外，HACE 还可以在连续传代的细胞中诱导连续的核苷酸多样化，使其适用于持续的生物进化研究。更加重要的是，HACE 对哺乳动物细胞的扰动极小。
图 2 HACE 设计示意图及编辑效果评估
HACE 能够识别 MEK1 抑制剂耐药突变
HACE 在现实研究中的应用效果如何呢？首先，他们将 HACE 用于筛选 MEK1 抑制剂（通过靶向 MAPK-ERK 通路用于癌症治疗）的耐药突变。他们基于 HACE 将靶向 MEK1 外显子区域的系统导入到 A375 细胞（一种对 MEK1 抑制敏感的黑色素瘤细胞系），并使用 Trametinib 和 Selumetinib 两种 MEK1 抑制剂进行耐药性点突变筛选。
在存活的细胞中，他们通过靶向扩增子测序发现了耐药突变体，包括 G128D，G202E 和 E203K。随后他们利用单碱基编辑器和 MAPK 通路的活性报告系统对这些突变进行了验证。此外，结构生物学的分析结果表明，G128D 位于配体结合口袋中，这种突变可能通过空间相互作用诱导结合袋的构象变化而起耐药作用（图 3）。总的来说，这些结果表明 HACE 可以识别赋予耐药性的突变，同时减少人工遗传连锁的混淆效应。除此之外，他们的研究结果还表明 HACE 能够协助研究人员确定导致 SF3B1 依赖性剪接错误的临床相关突变。
图 3 HACE 能够鉴定内源基因组中 MEK1 抑制剂的耐药突变
HACE 在非编码调控元件中的应用
HACE 在分析基因调控元件的潜力如何呢？研究人员将 HACE 定位到一个调节 CD69 的增强子区域，CD69 是一种膜结合凝集素受体基因，有助于免疫细胞组织驻留。他们设计了三种靶向 CD69 增强子核心区域的 sgRNAs，并用这些 nCas9-sgRNAs 和 HE 感染 K562 细胞。基于扩增子测序分析结果，他们找到了多个重要的转录因子结合区域并对分析结果进行了验证。例如，他们验证了 G>A 在 4879 和 4880 碱基上的转换抑制了 CD69 的诱导，而这些变异位于预测的 IRF/ETS 或 IRF/STAT 转录因子基序内，表明该基序和同源因子在 CD69 诱导中起重要作用。
此外，HACE 还筛查到一个特别有趣的结果，这与三个相邻的 C>T 转换（4995、4996 和 4998）有关（图 4）。后续的基序分析表明，这些变异位于 RUNX 家族转录因子识别的核心基序区域，这也与 CD69 调控有关。因此，这些结果支持 RUNX1/2 在 K562 细胞中驱动 CD69 诱导中的作用。总之，上述的实验结果表明 HACE 在碱基分辨率上系统解析非编码调控序列的潜力。
图 4 HACE 对顺式调控元件单碱基突变的鉴定
该研究报道了一个名为 HACE 的强大基因编辑技术，HACE 将整个基因座的远程编辑与 CRISPR-Cas9 基因编辑工具相结合，最终使内源性哺乳动物基因组的连续突变、远程编辑、多靶向等成为可能，并使编码和非编码基因组的系统序列功能图谱的建立成为可能。此外，HACE 还可以发展成为内源性基因组的定向进化系统，从而在哺乳动物生物学中选择所需的功能序列。
通讯作者（上下滑动查阅）
Fei Chen 博士于 2016 年获得麻省理工学院生物工程博士学位，目前是布罗德研究所核心研究员之一、哈佛大学干细胞和再生生物学助理教授。他，主要研究方向为空间生物学和合成生物学及相关新技术的开发，近年来以通讯作者在 Nature、Science、Nature Methods、Nature Biotechnology、PNAS 等杂志发表多篇高水平研究论文。
参考资料：
[1] Chen et al., Helicase-assisted continuous editing for programmable mutagenesis of endogenous genomes. Science. 2024 Oct 11.
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