《AM》：抗炎肽修饰的丝素蛋白/冷冻凝胶混合双纤维支架促进慢性伤口愈合

BioMed科技 · 公众号 · · 2024-02-01 20:14

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由糖尿病、压力、放射治疗等因素导致的慢性伤口在愈合方面仍然面临重大挑战。为了解决这个问题，国科大温研院陈世萱 &南通大学附属医院张逸 &南昌大学第二附属医院万文兵引入了一种新型的混合丝素纤维支架（FFS），它由随机排列的丝素纤维和垂直排列的冷冻凝胶纤维（CF）组成。丝素支架在室温下高效脱胶并同时形成多孔结构。通过控制溶液浓度和冷冻聚合温度，实现了定向冷冻干燥产生垂直排列的冷冻凝胶纤维。将垂直排列的冷冻凝胶纤维加入到扩展的丝素纤维支架中，增强了体外和体内的细胞浸润，进一步提高了混合支架的组织相容性。还将抗炎肽1（AP-1）偶联到混合纤维支架上，有效地将慢性伤口的炎症状态从促炎转变为促修复。因此，与商业产品PELNAC相比，FFS-AP1+CF组在增殖期表现出更优的肉芽组织形成、血管生成、胶原沉积和再上皮化。此外，FFS-AP1+CF组的表皮厚度、再生毛囊数量和胶原密度更接近正常皮肤组织。我们的发现突显了随机丝素纤维/垂直冷冻凝胶纤维混合纤维支架作为皮肤组织填充和组织再生的有前景的方法的潜力。该研究题为“Anti-inflammatory Peptide-Conjugated Silk Fibroin/Cryogel Hybrid Dual Fiber Scaffold with Hierarchical Structure Promotes Healing of Chronic Wounds”发表在《 Advanced Materials 》.

图1展示了使用钠硼氢化物作为脱胶剂在室温下制备扩展丝素蛋白纤维支架（FFS）的方法，并对其结构和性能进行了表征。首先，通过示意图说明了使用钠硼氢化物去除蚕丝中的丝胶蛋白并最终获得具有疏松结构的丝素蛋白纤维支架的过程。接着，展示了脱胶后FFS的照片，以及与使用碳酸钠溶液脱胶的FFS的体积变化对比。通过不同浓度的钠硼氢化物溶液处理蚕丝茧12小时后的脱胶率，以及在室温下使用1.5%钠硼氢化物溶液处理不同时间后的脱胶率，研究者们发现1.5%的钠硼氢化物溶液在5-9小时内即可有效脱胶。此外，还比较了不同浓度的碳酸钠溶液在3小时内的脱胶率，以及不同脱胶方法对丝素蛋白纤维结晶度的影响。通过拉伸测试，研究者们发现使用钠硼氢化物脱胶的丝素蛋白纤维具有比使用碳酸钠更强的拉伸强度。这些结果表明，钠硼氢化物溶液是一种理想的脱胶剂，因为它能够在室温下实现完全脱胶，保护丝素蛋白纤维的内部结构，使得脱胶后的丝素蛋白纤维具有更高的结晶度、纯度和机械性能。

图1：扩展丝素蛋白纤维支架（FFS）的制备和表征

【GelMA冷冻凝胶纤维（CF）的制备和表征】

图2展示了通过定向冷冻干燥技术制备的GelMA冷冻凝胶纤维（CF）的制备过程和结构特性。研究者们首先通过示意图描述了CF的制备流程，包括在不同温度下进行冷冻聚合以形成具有特定取向的纤维结构。接着，通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）图像展示了在-20°C和-190°C（液氮）下冷冻聚合形成的CF的内部结构。通过这些图像，研究者们观察到在-20°C下形成的CF具有较大的纤维直径和孔径，以及较高的孔隙率。此外，还通过假彩色图像展示了在不同温度下形成的CF纤维的取向角度映射。这些结果表明， 通过控制溶液浓度和冷冻聚合温度，可以有效地制备出具有对齐结构的CF，这对于后续的生物材料应用具有重要意义。

图2. 通过定向冷冻干燥制备的GelMA冷冻凝胶纤维（CF）的制备和表征

【扩展丝素蛋白纤维/冷冻凝胶纤维混合支架（FFS+CF）的制备】

图3展示了扩展丝素蛋白纤维/冷冻凝胶纤维混合支架（FFS+CF）的制备过程，并通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）图像展示了混合支架中丝素蛋白纤维和冷冻凝胶纤维的组成、分布、取向和形态。研究者们观察到，混合支架中的丝素蛋白纤维呈现出随机排列，而冷冻凝胶纤维则呈现出垂直排列。通过3D细胞迁移模型，研究者们发现人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能够在混合支架上从底部向顶部迁移，迁移距离随着培养时间的增加而增加。此外，通过皮下植入实验，研究者们发现FFS+CF混合支架在体内能够促进细胞浸润和胶原沉积，与FFS相比，FFS+CF组在植入1周后显示出更显著的细胞浸润和新血管形成。这些结果表明， 引入对齐的冷冻凝胶纤维到扩展的丝素蛋白纤维支架中，有效地促进了细胞浸润和血管化，有助于提高生物相容性和组织整合。

图3. 扩展丝素蛋白纤维/冷冻凝胶纤维混合支架（FFS+CF）的制备

【AP-1肽修饰的FFS+CF的炎症调节效果】

图4展示了抗炎肽AP-1修饰的FFS+CF混合支架对伤口愈合早期炎症反应的调节效果。研究者们首先通过示意图描述了FFS-AP1+CF支架的制备过程，然后通过RNA-seq分析确定了与炎症反应相关的76个差异表达基因。这些基因影响炎症细胞如单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的行为，并参与促进炎症细胞的激活、分化、趋化和细胞因子产生。通过免疫组化染色，研究者们观察到FFS-AP1+CF组在伤口边缘和中心区域的CD45（泛白细胞）表达较低，表明白细胞浸润减少。Ly6G（单核细胞、粒细胞和中性粒细胞的标记）和CCR7（M1型巨噬细胞的标记）的表达在FFS-AP1+CF处理的伤口中显著降低，而CD206（M2型巨噬细胞的标记）的表达则显著增加。这表明AP-1的使用促进了从促炎到促再生状态的转变。KEGG富集分析进一步揭示了AP-1通过抑制关键的炎症相关信号通路（包括TNF信号通路、NF-κB信号通路和JAK-STAT信号通路）来调节炎症反应。这些发现表明，FFS-AP1+CF支架在伤口愈合过程中能够有效地调节炎症环境，为伤口修复创造有利条件。

图4. AP-1肽修饰的FFS+CF的炎症调节效果

【体内伤口愈合评估】

图5展示了体内伤口愈合评估的结果，包括对照组（Control）、FFS+CF组、FFS-AP1+CF组和商业产品PELNAC组在治疗7天和14天后的伤口愈合情况。通过H&E染色，研究者们观察到FFS-AP1+CF组在增殖期表现出更优的肉芽组织形成、血管生成、胶原沉积和再上皮化。在治疗7天后，FFS-AP1+CF组的再上皮化率达到了56.02%，超过了其他三组。到治疗14天时，FFS-AP1+CF组和PELNAC组实现了完全再上皮化。Trichrome染色进一步揭示了FFS-AP1+CF组在治疗第7天和第14天相对于对照组、FFS+CF组和PELNAC组有更多新形成的血管和沉积的胶原基质。此外，FFS-AP1+CF组在治疗21天后新表皮的厚度恢复到了健康水平，而PELNAC组的表皮仍然比正常厚。 FFS-AP1+CF组在治疗21天后再生的毛囊数量也超过了其他治疗组，这表明FFS-AP1+CF组能够促进伤口愈合并改善愈合质量。这些发现强调了FFS-AP1+CF在伤口愈合和组织再生中的有益效果。

图5. 体内伤口愈合评估

【FFS-AP1+CF混合支架在伤口愈合炎症和增殖阶段的作用示意图】

图6概括了FFS-AP1+CF混合支架在伤口愈合过程中的作用机制。该图展示了混合支架如何通过在炎症和增殖阶段调节伤口微环境，以及最终实现高质量愈合的目标。在炎症阶段，FFS-AP1+CF支架通过AP-1肽的抗炎作用，有效抑制了炎症反应，减少了炎症细胞的浸润，促进了M2型巨噬细胞的极化，为伤口愈合创造了有利条件。在增殖阶段，混合支架促进了肉芽组织的形成、血管生成和胶原沉积，加速了伤口的闭合和组织重建。这些过程共同作用，使得FFS-AP1+CF支架在促进慢性伤口愈合方面表现出显著的潜力，为临床治疗提供了一种有前景的策略。

《AM》：抗炎肽修饰的丝素蛋白/冷冻凝胶混合双纤维支架促进慢性伤口愈合

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