福建农林大学周顺桂等The Innovation Geoscience：宏基因组-SIP技术揭示土壤活性病毒在氮循环中的潜在作用

随着多组技术的进步，环境中病毒生态功能被逐渐认识。尽管病毒携带氮元素循环的辅助代谢基因（Auxiliary metabolism genes，AMG），然而，尚无实验证据表明病毒参与土壤氮循环。为此，本文利 用宏基因组-SIP技术 研究活性病毒在土壤氮循环中的作用。

病毒是地球上最丰富的生物实体，但其在土壤生态系统中的作用仍不明确。尽管在土壤病毒组中发现了反硝化基因（ norD 和 norQ ），但迄今为止，尚无实验证据表明病毒参与土壤氮循环。为此，本研究联合 ¹⁵ N-稳定同位素示踪（SIP）与宏基因组，表征了土壤活性病毒（具有感染宿主活性）侵染固氮细菌特征。通过观测细菌在土壤培养过程中对 ¹⁵ N的吸收情况，揭示了 ¹⁵ N在不同营养水平之间的迁移，为病毒参与氮循环提供了实验证据。

为了探究土壤病毒在调控氮素循环中的作用，本研究首次联合 ¹⁵ N-稳定同位素示踪（SIP）与宏基因组，表征了具有感染宿主活性的土壤活性病毒与固氮细菌之间的关系。实验处理设置如下：i) 处理组：10 g土壤样品装在60 ml血清瓶中，顶空为50 ml O ₂ 和 ¹⁵ N ₂ ; ii)对照组：只将 ¹⁴ N ₂ 代替 ¹⁵ N ₂ ， 其他条件与处理组相同。每个处理重复三次，孵育90天（30℃），在实验开始后的第0、30、60和90天取样分析（图2A）。

图2 宏基因组-SIP微宇宙实验设计示意图及 ¹⁵ N同位素丰度和微生物多样性差异

在同位素标记孵育过程中，土壤中 ¹⁵ N同位素丰度在孵育30天后显著高于对照组，在孵育90天后差异达到最大值（图2B），表明土壤微生物参与了N ₂ 固定。将 ¹⁵ N ₂ 和 ¹⁴ N ₂ 处理组的DNA样本经过超速离心分层后进行宏基因组测序，研究参与N循环的活性病毒及其宿主。基于宏基因组测序，共获得了609个大于5 kb的病毒基因组（vOTUs）。通过比较 ¹⁵ N ₂ 不同组分之间的病毒群落，发现重组分的病毒和细菌Richness和群落组成（p< 0.05）低于轻组分（图2C），表明15N标记病毒和细菌只是少部分。基于 ¹⁵ N ₂ 和 ¹⁴ N ₂ 处理的线性判别分析，发现65个vOTU只富集于 ¹⁵ N ₂ 标记的重组分处理，表明这些病毒可能参与了氮素转化（图3A）。

基于15N宏基因组-SIP，共鉴定到10个具有氮代谢潜力的细菌MAGs，其中3个编码固氮基因 nifH （图3B）。基于CRISPR-spacer病毒宿主预测，3个氮代谢MAGs与4种病毒存在潜在宿主关系。其中MAGs （bin 23和bin 46）编码亚硝酸盐还原酶基因（ nirB 和 nirD ）, 鉴定到MAGs被两个烈性病毒侵染。此外，溶解病毒vOTU1具有感染固氮细菌bin 6。同时， ¹⁵ N标记的病毒与宿主丰度在同位素重层具有一致变化关系，表明病毒与宿主之间具有紧密的动态偶联（图4A）。此外，通过DRAM-v注释病毒辅助代谢基因（AMGs）。在vOTUs中发现了两个参与羟胺代谢的羟胺脱氢酶AMGs（ hao ，图4B-C）。表明，病毒可以帮助氨氧化细菌将羟胺转化为亚硝酸盐的潜力，减轻因羟胺对宿主的毒害作用。上述结果表明，病毒通过侵染氮转化细菌和携带AMGs参与氮循环过程。

图3 宏基因组-SIP揭示氮循环中活性病毒和MAGs的丰度变化

综上所述，宏基因组结合DNA-SIP技术为病毒通过自上而下调控氮循环提供了实验证据：活性病毒裂解固定细菌和编码氮循环的辅助代谢基因参与土壤氮转化。本研究表明活性固氮菌固定N同位素可以通过病毒裂解扩散到病毒基因组中，为研究病毒在土壤中氮周转提供了重要实验证据。

图4 土壤病毒参与氮循环的实验证据

责任编辑

孙 晶  中国石油大学（北京）

杨 阳  中国科学院地球环境研究所