做miRNA测序的文库制备，要注意哪几点？

miRNA（MicroRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，能在转录后调控基因表达，所以近来越来越备受关注。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。并且相对稳定，在各种生物体液中被发现，也成为许多疾病的生物标志物，如癌症。

通常研究miRNA是利用RT-qPCR和芯片，但是这些技术只能分析已知的miRNA种类，而miRNA-Seq能帮人们发现新东西。miRNA尽管在本质上与其它RNA相同，但在样本的一些处理步骤上是不一样的。本文介绍一些最新方法，帮助高效制备miRNA-Seq文库

miRNA，非RNA

目前的文库制备和PCR技术已经相当好，不需要特别富集小RNA（smRNA）。最关键的要求是RNA制备要干净，且没有肝素（这是一种相当强的RT抑制剂）。需要注意的是，在提取RNA时应保留小RNA。加州大学的专家表示：修改标准的RNA提取方案，采用更高浓度的盐沉淀，可以确保小RNA被回收。对于那些倾向于试剂盒的研究人员，建议使用Zymo Research的产品，因为它们“价格便宜效果好”。如果起始量低，他建议使用Norgen Biotek的试剂盒。

棘手的接头二聚体

然而接头的连接带来了一些问题，3’和5’接头可能彼此连接，形成二聚体。二聚体过多的话则占据了宝贵的测序资源，使较低丰度的物种无法测序，甚至造成整个运行损失。

科学家表示：仪器需要一个非常多样化的文库，以确保它们能够区分各个簇，而提供正确的序列，而接头二聚体始终是相同的序列。

意识到这个问题，并采用一些策略来防止或去除引物二聚体。

最显而易见的方法就是大小选择（size selection），这也可以作为纯化步骤来去除其他污染。大小选择至少可通过三种方式完成。康奈尔大学的副教授认为，凝胶电泳再加上手动切胶是传统的方法，但相当费力，特别是在制备大量样本时。

Sage Science的Pippin Prep自动化DNA大小选择系统“效果非常好，但成本至少是两万美元” ，因此只能在一些核心实验室见到它.

第三种方法是基于磁珠的选择。这种方法的分辨率不大，能区分接头二聚体和带插入片段的文库，快速方便，因此一些试剂盒会推荐。

一些试剂盒则另辟蹊径，阻止接头二聚体的形成。有的在添加5’接头之前，去除过量的3’接头。

有的则利用化学修饰的接头，阻断二聚体的形成。比如QIAGEN的QIAseq miRNA Library Kit，它利用修饰寡核苷酸的专利方法几乎避免了测序文库中接头二聚体的存在，有效去除了测序过程中经常观察到的主要污染物。

另一个选择是一开始不连接接头。Takara和Diagenode的试剂盒是利用聚腺苷酸化、逆转录、模板转换以及PCR的组合来创建带有条形码接头的RNA-Seq文库。

这些策略旨在减少接头连接的偏倚。