今天讲的这篇文章就挺有意思，他们发现了心脏内皮细胞中Notch1的异位表达（
Notch1这个大家应该都熟悉，特别是Notch信号通路中，Notch1被三次水解，成为了NICD后，入核启动转录的过程，不熟悉的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列
）。这篇文章就是上海交通大学医学院附属新华医院的博士，发表在14.7分的Nature Communications上的文章，我们就一起来看看他们做了点什么吧：
因为大家熟悉Notch信号通路的话，应该都知道Notch激活的过程，是通过NICD，也就是Notch的胞内结构域，入核启动转录的过程。而现在有很多文献表明，其实NICD并不一定都会进入细胞核。而他们发现，在血管内皮细胞和HEK293细胞系中，Notch1的胞内结构域NICD1，其实是可以与线粒体共定位的。而通过对NICD1上各个位点分段缺失来分析后，他们发现NICD1中的确存在着线粒体定位的序列。于是他们提出了一个假设，假设NICD1的线粒体定位，可能存在着潜在的功能（
这样的假设提出，其实就是为了更好地推动课题，既然NICD1能够异位表达，也就是进入线粒体，那么就说明NICD1可能存在潜在的线粒体中的功能，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）：
那么NICD1参与线粒体功能，也就是说NICD1是可以和线粒体中的蛋白相互作用的。于是他们通过质谱分析后，进行了筛选，发现线粒体中的PDH可以与NICD1结合（
虽然说是筛选，但其实也就是通过归纳法，对潜在的组合进行了合理的假设和预测，其实假设和假设的迭代，才是一篇文章推进过程中的关键，不清楚假设和假设迭代以及归纳法的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》
）。通过BiFC的荧光鉴定，也就是在NICD1和PDH上分别表达半个Venus荧光，当两个蛋白存在互作的情况下，才能产生荧光。结果显示PDH的确能与NICD1结合互作：
PDH是丙酮酸脱氢酶，也就是将丙酮酸转换为乙酰辅酶A后，进入TCA循环的关键。那么NICD1与PDH的结合，是否会影响丙酮酸代谢过程中有氧呼吸和无氧呼吸的转换呢？于是他们敲除了Notch1，然后补充线粒体NICD1，查看了丙酮酸产物的变化情况（
这个其实就是柯霍氏法则的验证，通过移除关键了Notch1，来查看可能与Notch1的胞内结构域NICD1互作的PDH的功能是否产生变化，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》
）。他们发现NICD1的确能影响PDH的功能，也就是会影响丙酮酸的去向，并对有氧呼吸产生影响：
而通过coIP实验发现，NICD1只能和PDHB结合， 通过与PDHB的直接相互作用，与PDC（包含PDHA1、PDHB、DLD、DLAT的复合体）结合。其中PDHA1的磷酸化，则会受到NICD1的影响，当NICD1结合到PDC复合体上之后，PDHA1的磷酸化便明显降低。PDHA1的磷酸化降低，则能激活PDC复合体的活性。而PDK是通过对PDHA1进行磷酸化，来抑制PDC复合体活性的；PDP则通过对PDHA1的去磷酸化，激活PDC复合体活性。而mitoNICD1，显著降低了内皮细胞中PDHA1与PDK1-4和PDP1之间的相互作用，同时降低了PDHA1的磷酸化，从而激活了PDHA1的活性：
外源的NICD被认为可以激活细胞的EMT（内皮间质转换），于是他们进一步进行了假设的迭代，他们假设NICD对于细胞的内皮间质转换，是通过NICD进入线粒体后，影响氧化呼吸导致的（
假设的迭代其实就是通过已知信息进行分析后，更新的假设，他们发现NICD可以通过进入线粒体，对PDC复合体产生作用，从而影响氧化呼吸，于是他们就将EMT与之联系了起来，形成了新的假设，从而推进了课题的进展，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。他们的验证也挺有意思，由于NICD1进入线粒体后是通过PDHA1的磷酸化产生功能的，于是他们就使用了PDH的激活剂和抑制PDH的PDK激活剂，来进行验证。通过分析内皮细胞标志物和间质细胞标志物，确定了NICD1的确是通过PDH，影响了细胞的EMT：
由于EMT的缺陷，在先天性心脏缺陷患者的心脏组织中常见。于是他们通过临床样本分析，确定了Notch1在先天性心脏缺陷患者中的突变体。通过对这些Notch1突变的组织样本中PDHA1的功能缺陷，确定了Notch1不能进入线粒体，会降低了PDH活性：
这篇文章其实从选题到研究，都做得挺有意思，不但分析获得了NICD异位表达所产生的后果，也就是影响PDH的活性，并且还能结合临床，对先天性心脏病的成因进行了分析。结构还是比较完整的，完成度也挺高。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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