随着使用腺相关病毒（AAV）载体的肝脏靶向基因疗法开始进入临床，如何从众多可用选项中选择最有效的衣壳已成为一个紧迫的问题。AAV基因转移到肝细胞的临床前模型包括小鼠、“人源化”小鼠和非人灵长类动物，但这些模型都无法准确预测AAV载体在人类中的安全性和有效性。
近日，
加州大学
Holger Willenbring等人
研究了在常温机器灌注下离体维持的正常和脂肪变性人类肝脏中的
AAV
基因转移。
他们的方法代表了在临床前环境中模拟人类基因转移的最接近的方法。
该研究为衣壳在肝环境中AAV转导中的作用提供了突破性的见解，包括将肝窦内皮细胞（LSEC）作为肝细胞的替代靶点进行转导
。
此外，作者发现，与非脂肪变性肝脏相比，脂肪变性肝脏的转导模式发生了意想不到的变化。
鉴于脂肪肝在人群中的高患病率，这些发现对基因治疗具有重要意义。
近年来，基于体内AAV基因转移的几种基因疗法已获得监管部门的批准，更多的基因疗法正在进行高级临床开发。一个重点领域是肝脏基因转移，用于将治疗性蛋白质输送到体循环和纠正肝脏疾病。目前，这些方法依赖于肝细胞中的转基因表达，例如在三种获批的用于治疗血友病的凝血因子表达药物中。用于基因递送的病毒衣壳的选择取决于所需的组织和细胞取向；选择范围从自然发生的变体到许多实验室进化或工程变体。
然而，该领域的一个主要挑战是物种之间的差异以及缺乏能够准确预测人类AAV基因转移疗效的临床前模型。小鼠往往无法预测人类的衣壳表现，这促使人们使用被认为更具翻译相关性的替代模型。这些包括非人灵长类动物和“人源化”小鼠，它们具有用原代人肝细胞重建的嵌合肝脏。非人灵长类动物和人源化小鼠模型的结果经常出现分歧，后者为临床试验结果提供了更可靠的预测。然而，人源化小鼠仍然存在局限性，例如缺乏某些人类肝细胞类型（如LSEC）和广泛的免疫缺陷。
图|研究和预测AAV载体肝导向人类基因治疗疗效的临床前模型。a、目前的最新技术是在非人灵长类动物和植入人肝细胞的人源化小鼠中测试AAV衣壳变体。全肝移植的常温灌注具有明显的优势。尽管在进化上很接近，但非人灵长类动物的肝细胞显示出与植入人源化小鼠的人肝细胞不一致的衣壳反应，这一优势在人肝移植中仍然存在。肝外植体包含人源化小鼠中缺失的所有非实质细胞。当前外植体模型的一个局限性是研究时间有限，只有部分免疫反应。b、肝导向基因治疗中一个很大程度上未被探索的领域是脂肪变性的存在。对正常和脂肪变性外植体中的五种AAV载体衣壳进行比较，发现了多种差异，包括分区、非实质细胞（如LSEC）的转导和载体DNA的分子形式
尽管肝脏充当大多数静脉注射AAV载体的聚集池，但由于进入和进入后的限制，肝细胞的转导差异很大。
例如，病毒颗粒可能进入细胞，但无法将基因组递送到细胞核，或者递送的基因组可能无法完全无涂层、稳定或表达，原因尚不完全清楚。病毒衣壳和宿主特异性或物种特异性因素在这些结果中都起着重要作用，这突显了在临床前环境中更接近模拟人类基因转移的模型的必要性。
常温机器灌注是移植前保护器官健康的最新临床进展，其中供体肝脏被血液制品灌注，与冷保存方法相比，这改善了移植后的结果。该技术最近被应用于AAV转导的研究。
该研究大大发展了这一方法，并评估了五种AAV衣壳在正常和脂肪变性肝脏中的转导效率。他们的结果与在小鼠身上观察到的结果明显不同，尽管它们在很大程度上与在人源化小鼠身上的发现一致。
衣壳LK03（来源于衣壳文库，与AAV3高度相似）实现了最高百分比的转基因表达肝细胞，这与早期对基于AAV3的载体的研究一致。
有趣的是，尽管AAV6（用于血友病a的3期试验）在递送载体基因组方面最有效，但在产生荧光团转基因表达方面效果要差得多。在人类和人源化小鼠肝脏中，AAV5在人类肝细胞中的表现最低。AAV5用于血友病A和B的前两种临床批准的肝脏导向基因疗法，其优势在于其在人群中预先存在的体液免疫水平较低（这使得能够治疗更多的患者）。
脂肪性肝病已成为一个相当大的全球公共卫生问题，主要是由于代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（以前称为非酒精性脂肪肝）的患病率上升和高危饮酒模式的转变。据估计，44-57%的血友病患者患有肝脂肪变性。然而，肝细胞中脂肪积聚对AAV基因转移的影响在很大程度上仍未得到探索。
在本研究中，研究人员通过比较两个显微镜下正常的肝脏和两个脂肪变性的肝脏来解决这个问题。
他们的研究结果表明，脂肪变性对AAV基因转移具有复杂的多效作用。在某些情况下，转导的区域模式（门静脉周围与中心周围）可能会改变，其潜在影响因治疗的特定疾病而异。对肝细胞和LSEC的相对取向也可能受到影响，分子形式的形成和载体基因组的稳定性也可能受到冲击。接受基于体重的AAV基因治疗血友病B的患者的数据显示，体重指数与转基因表达水平之间存在相关性，这支持了脂肪含量增加的肝脏环境可能影响基因转移结果的观点。
在机器灌注模型中，发现AAV5和AAV8除了转导肝细胞外，还转导LSEC，这种取向不同于它们在小鼠中的行为，尤其与针对血友病a（因子VIII缺乏症）的基因治疗有关
。有趣的是，作者表明，
在脂肪变性的情况下，AAV5增强了LSEC的转导，而LK03则保持了其对肝细胞转导的偏好，与脂肪变性无关
。目前批准的基因疗法以及处于3期试验中的基因疗法使用肝细胞特异性启动子靶向肝细胞。然而，LSEC是因子VIII合成的天然位点，与von Willebrand因子的共表达促进其分泌到血液中。由于AAV载体基因组通常在分裂细胞中丢失，LSEC的周转可能会对长期治疗效果构成挑战。
该研究的一些研究结果应在长期研究中进行评估和确认。例如，作者提供的证据表明，LSEC的周转率与肝细胞的周转率相似，众所周知，肝细胞支持长期AAV转基因表达。然而，在基因转移多年后，从血友病A患者的AAV5转导肝脏中采集的活检显示，载体基因组在肝细胞中高度持久，但在LSEC中没有。此外，在目前的研究中，发现AAV5衣壳可以减少游离载体基因组的连接体形成，这可能会损害肝细胞中基因转移的稳定性。尽管如此，基于AAV5的血友病B肝基因治疗在几年内显示出稳定性。这些发现强调了进一步研究基因转移的长期稳定性以及载体选择对治疗结果的影响的必要性。
在目前的肝脏灌注模型中进行的研究仅限于几天，尽管一些移植的肝脏可以保持功能一周以上。其他进展，如分流灌注，能够对特定变量进行更可控的测试。总之，外植体肝脏灌注模型代表了临床前肝脏研究的一项重大技术突破。它在解决肝脏AAV基因转移的关键挑战方面具有相当大的前景，提供了与患者基因治疗直接相关的见解，并可能成为其他肝脏疾病的临床前模型。
参考文献“
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